Индикатор напряжения мин 1: Индикатор напряжения МИН-1. Цена и условия поставки от компании МСК-СНАБ. Наша компания занимается продажей оборудования с хранения. Наша почта msksnab@mail.ru. тел: 8(499)707-76-61 — Светодиодные светильники и корпуса для светильников купить оптом в Москве

Индикатор напряжения мин 1: Индикатор напряжения МИН-1. Цена и условия поставки от компании МСК-СНАБ. Наша компания занимается продажей оборудования с хранения. Наша почта [email protected]. тел: 8(499)707-76-61

Содержание

Мин 1 индикатор напряжения цена

Основные атрибуты
Страна производитель	СССР Россия
Состояние	Новое
Функции	Прозвонка цепи
Монитор	Нет
Индикация	Световая
Питание	Сеть от 110В
Напряжение	500.0 (В)

Показать все

Индикатор напряжения МИН 1

Цена указана без НДС и действительна при оплате на ООО. При оплате на ИП возможна скидка до -30%.

Назначение.
МИН1 предназначен для работы в электрических цепях с частотой тока 50 Гц и напряжением от 110В до 500В.

Делаем доставку по городам и регионам: Москва, Тверь, Тула, Брянск, Липецк, Смоленск, Нижний Новгород, Ярославль, Вологда, Санкт-Петербург, Петрозаводск, Казань, Ульяновск, Пенза, Самара, Саратов, Волгоград, Ростов-на-Дону, Краснодар, Ставрополь, Владикавказ, Махачкала, Уфа, Оренбург, Челябинск, Мурманск, Салехард, Ханты-Мансийск, Омск, Тюмень, Барнаул, Абакан, Красноярск, Иркутск, Чита, Хабаровск, Владивосток, Майкоп, Улан-Удэ, Горно-Алтайск, Назрань, Нальчик, Элиста, Черкесск, Петрозаводск, Сыктывкар, Йошкар-Ола, Саранск, Якутск, Казань, Кызыл, Ижевск, Чебоксары, Благовещенск, Архангельск, Астрахань, Белгород, Владимир, Воронеж, Иваново, Калининград, Калуга, Петропавловск-Камчатский, Кемерово, Киров, Кострома, Курган, Курск, Магадан, Великий Новгород, Новосибирск, Орел, Пермь, Псков, Рязань, Южно-Сахалинск, Екатеринбург, Тамбов, Томск, Анадырь и т. д.

2 — с хранения
—

Описание
Предложить цену
Наличие

Характеристики
Номенклатурная группа индикатор напряжения
Базовая единица шт
Модель МИН-1
Вы можете задать любой интересующий вас вопрос по товару или работе магазина.
Наши квалифицированные специалисты обязательно вам помогут.
Предложить цену

Персональные рекомендации

Указатель напряжения УННУ-1Н 50-1000В

Указатель напряжения WN-1-1

Стабилизатор напряжения Uniel (09496) 500ВА RS-1/500LS

Указатели напряжения F&F WN-1 (ЕА04. 007.006)

Указатель напряжения УННУ-1Н, световой индикатор, поляр.

Указатель высокого напряжения УВН80-2М 6-10кВ с газораз.

Указатели напряжения F&F WN-1 (ЕА04.007.006)

Указатель тока цифровой F&F WT-1 (ЕА04.008.001)

Указатель напряжения ЭИ-9000 от 50-1000В

Индикатор напряжения ПИН-90М 50В-1000В переменного и по.

Указатель напряжения ЭЛИН-1 СЗ с испытанием

Указатель напряжения СЕМ DT-9902

указатели напряжения тока F&F WN-1 230в

IEK Мультиметр MY64 + индикатор напряжения ОП-1 TMD-5S-.

Однофазный индикатор напряжения V1F (2 модуля)

Указатель напряжения ЭЛИН-1 СЗ ИП М с испытанием

Указатель напряжения однофазный LK-712 (EA04.007.001)

Указатель напряжения УНН-1Д (40-1000В) Диэлектрик

Указатель напряжения ПИН-90М ВЛ (UNN102)

Указатель напряжения «WN-1-1», 1 фаза, 230 В.

Указатель напряжения УНН-1 СЗ ИП с испытанием

тестер напряжения yato 1. 5-9v 70-250v звуковой

Указатель напряжения «WN-1-1», 1 фаза, 230 В.

Указатель напряжения ПИН-90

Указатель напряжения и правильности подключения DT-9021.

Указатель напряжения ЭИ-9000, световой индикатор, поляр.

Вольтметр (индикатор напряжения) РН-11 1-ф, диапазон из.

Указатель напряжения Евроавтоматика F&F WN-1-1, 230.

Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.

Однофазный индикатор напряжения V1F (2 модуля) (за 1шт.

DMV-1T указатель напряжения

Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.

Указатель напряжения Мегеон 55001

Указатель низкого напряжения унн-1 д 40-1000В диэлектри.

Указатель напряжения WN-1, однофазный, 100-300В, цифров.

Zamel Указатель уровня напряжения 1Ф 195-245VAC IP20 на.

Указатель напряжения трехфазный LK-713 (EA04.007.002)

Указатель напряжения Евроавтоматика F&F WN-1-1, 230.

Указатель напряжения УН-1Н-М с испытанием

Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.

Указатель низкого напряжения Контакт 53 ЭМ (UNN127)

Детектор напряжения FLUKE 1AC-E2-II

Беcконтактный индикатор напряжения Fluke LVD1A с фонаре.

Указатель напряжения wn-1-1 (1ф 100-300в цифр. индик. 3.

Индикатор напряжения IEK ОП-2Э

Однофазный индикатор тока и напряжения VA1F (2 модуля).

Zamel Указатель уровня напряжения 1Ф 195-245VAC IP20 на.

Указатель высокого напряжения увн-10 д световая индикац.

Детектор напряжения — 5 шт FLUKE 1AC-E1-II-5PK

Указатель напряжения УННЗП (12-380) — Указатели и индикаторы напряжения (НИЗКОВОЛЬТНЫЕ) — Продукция — КазЭкспорт Новосибирск

Общее описание

Указатель напряжения УННЗП (12-380) предназначен для контроля наличия напряжения в электроустановках переменного тока частотой 50Гц и постоянного тока напряжением 12-380В при температуре воздуха от +40ºС до -45ºС и относительной влажности не более 98% при температуре +25ºС. Указатель обеспечивает ступенчатую импульсную светозвуковую индикацию напряжения постоянного и переменного тока 12,50,110,220,380В, позволяет определить полярность постоянного и фазу переменного напряжений, целостность электрических цепей с внешним сопротивлением от 0 до 100 кОм ( светозвуковая прозвонка).

Определение целостности цепи осуществляется от энергии накопительного конденсатора. Зарядка конденсатора осуществляется от сети постоянного или переменного тока напряжением 220-380В в течение 1 минуты. Одной зарядки достаточно для работы в течение всего рабочего дня.

В варианте для работы на воздушных линиях указатель комплектуется двумя съемными удлиняющими электродами.

Технические характеристики

Диапазон проверяемого напряжения, В	12-380
Номинальные напряжения, В	12,50,220,380
Ток при макс. значении напряжения, мА, не более	10
Минимальное напряжение срабатывания указателя, В, не более	11
Диапазон прозвонки цепи, кОм	0- 100
Время сохранения работоспособности указателя после одной зарядки, час, не менее	24
Время непрерывной работы от одной зарядки при нулевом сопротивлении измеряемой цепи, мин, не менее	7
Время зарядки конденсатора, мин, не более	1
Длина гибкого соединительного провода, м, не менее	1,1
Длина неизолированной части контактов-наконечников, мм, не более	7
Габаритные размеры корпуса, мм	175х25х30
Габаритные размеры в упаковке, мм	230х80х35
Масса, кг, не более	0,10

КОМПЛЕКТ ПОСТАВКИ

Указатель УННЗП (12-380)	1 шт.
Паспорт и инструкция по эксплуатации	1 экз.
Чехол	1 шт.

Как пользоваться двухполюсным указателем напряжения. Как правильно пользоваться индикатором напряжения

При проведении любых электромонтажных работ крайне важно выполнять проверку наличия напряжения на объекте. Делается это с помощью специальных индикаторов и указателей. При этом, для каждого вида электрооборудования существует свой способ индикации. Какие типы указателей напряжения предлагает современный рынок, что нужно учитывать при выборе индикатора и для чего использовать конкретное устройство – читайте ниже.

Какие бывают индикаторы напряжения

Для того, чтобы правильно определить напряжение в сети, необходимо знать какие бывают измерители напряжения и где их можно использовать. Все индикаторы напряжения делятся на устройства для выявления высокого напряжения и приборы для использования на низковольтных объектах. Выбор индикатора для контроля над наличием напряжения зависит от типа электрооборудования. Так, для установок с электрическим потенциалом до 1000в применяют индикаторы и указатели низкого напряжения.

Указатели низковольтного напряжения могут быть:

Однополюсными;
Двухполюсными.

Однополюсный указатель используют для идентификации напряжения только в цепи переменного тока. Принцип действия такого прибора основан на проходимых способностях емкостного тока. Двухполюсный индикатор используют для определения наличия напряжения в цепях и переменного, и постоянного тока. Такое устройство работает по принципу прохождения активного тока.

Указатели высокого напряжения используют для фазировки высоковольтных кабелей и оборудования с электрическим потенциалом выше 1000 вольт.

Чаще всего, такие устройства применяют для отслеживания наличия напряжения на воздушных линиях электропередач. Кроме того, их можно использовать для фазировки (прозвонки) силовых трансформаторов и другого электрооборудования с напряжением переменного тока до 10 кВ.

По типу связи с токопроводящими частями электрооборудования высоковольтный индикатор может быть:

Контактный;
Бесконтактный;
Комбинированный.

Кроме того, указатели напряжения различают по типу индикации. Так, индикация в низковольтных и высоковольтных указателях может быть устроена на основе светового, звукового и свето-звукового сигнала. В некоторых приборах, в качестве основного элемента индикации, может использоваться цифровой экран.

Индикаторы напряжения до 1000 В

Наиболее доступным и простым, а потому и наиболее популярным, указателем напряжения до 1000 В является индикаторная отвертка. Современный рынок электроизмерительного оборудования предлагает широкий ассортимент индикаторных отверток. Самые доступные – однополюсные приборы, оснащенные неоновой лампой и добавочным сопротивлением.

Они способны проводить измерения переменного тока напряжением до 500 В.

Чаще всего, однополюсные индикаторы используют для:

Проверки вторичных цепей;
Определения фазного провода;
Правильного подключения электросчетчиков , диммеров и выключателей, ламп, предохранителей и т.д.

Более широкую сферу использования имеет двухполюсный УНН. С помощью такого устройства можно проводить измерения и переменного, и постоянного тока с напряжением до 1000 В.

Благодаря конструкции двухполюсные индикаторы можно использовать для установки наличия или отсутствия такового напряжения между двумя точками электроустановки.

С помощью двухполюсных индикаторов (например, МИН-1) можно также проводить проверку цепи на обрыв. В качестве индикации в таких приборах могут использоваться светодиоды, неоновые лампы. Существуют комбинированные устройства, световая индикация в которых дополнена звуковой. Использование двухполюсных приборов позволяет получить наиболее полную картину о наличии напряжения.

Цифровой индикатор напряжения: для чего он нужен, как выбрать

Самым распространенным цифровым двухполюсным индикатором напряжения является мультиметр. Этот электрический измерительный прибор позволяет определить не только напряжение переменного и постоянного тока в сети, но и его силу и частоту. Пользоваться таким прибором очень просто, поэтому его часто выбирают для решения бытовых задач.

К основным критериям выбора бытового мультиметра относят:

Процент его погрешности. Так, степень погрешности бытового мультиметра должна быть не более 3%. Для профессиональных моделей этот показатель может быть снижен до 0,025%.
Скорость срабатывания прибора. Чем больше выработок может дать прибор в секунду, тем лучше. Качественный мультиметр должен давать от 70 до 300 выборок в секунду.

Класс электробезопасности мультиметра. Выбор мультиметра по классу зависит от того в каких цепях его будут использовать. Так современные мультиметры можно использовать в локальных, внутренних низковольтных и внешних распределительных цепях.
Уровень пожаробезопасности прибора. Современные измерительные устройства должны оснащаться функциями защиты от перегрузок и автоотключением.

Не стоит забывать и про комплектацию прибора. Большинство современных мультиметров оснащаются специальными щупами или токовыми клещами, позволяющими проводить измерения без выпайки элемента из схемы и не нарушая изоляции проводника.

Отдельно выделяют световые индикаторы для установки в электрических распределительных щитах. Такие индикаторы имеют вид автомата, устанавливаются на DIN-рейку, могут использоваться как в однофазных (220 В), так и в трехфазных (380 В) сетях.

В зависимости от возможности подключения фаз автоматы делят на:

Индикаторы наличия напряжения на 1 фазу;
Индикаторы наличия напряжения на 2 различные фазы;
Указатели наличия напряжения в трехфазной сети;
Устройства для индикации напряжения в сетях на 12В и 24В.

Кроме того, автоматы делят в зависимости типа фазы. Так, отдельно можно установить автомат с индикатором напряжения на А (L1), В (L2) и С (L3) фазу. При этом, световая индикация будет соответствовать по цвету фазе. Так, например, автомат на А фазу будет иметь световую индикацию желтого цвета. Автоматические индикаторы на 3 фазы будут иметь отдельные световые индикаторы под каждую фазу.

Как выбрать автоматический индикатор напряжения сети

При выборе автомата с индикатором напряжения необходимо обращать внимание на диапазон отображаемых напряжений. Так, устройства на 3 фазы должны определять напряжение в диапазоне от 100 до 415 В. Автоматы на 2 фазы могут определять напряжение в диапазоне от 100 до 300 В. Чем шире диапазон напряжения устройства, тем лучше.

Кроме того, при выборе автоматических выключателей с индикаторами напряжения следует учитывать:

Степень погрешности устройства. Стандартные бытовые автоматы с индикацией напряжения должны иметь степень погрешности не более 3%.
Степень защиты устройства. Для внутренней установки подойдут устройства с маркировкой IP20.
Тип индикации. Простые модели имеют световую индикацию, представленную светодиодной лампой . Более дорогие модели могут иметь 3-х разрядное цифровое табло для отображения значений.
Индекс устройства. Простые автоматы обозначаются буквой С. Автоматы с индикацией, чаще всего, имеют маркировки PMT, PH, SVN в зависимости от типа устройства и производителя.

Приобрести автоматы с индикацией можно в специализированных магазинах для электриков или интернет-магазинах. При этом, следует учитывать производителя автомата. Так, наиболее качественными считаются устройства немецкого производства. Среди лучших производителей электроизмерительных приборов можно выделить компанию Hager.

Как работает указатель напряжения (видео)

Индикаторы высокого и низкого напряжения – это наиболее распространенные средства электрозащиты, которые позволяют идентифицировать наличие напряжения на объекте. На сегодня, все индикаторы делятся на низковольтные и высоковольтные. Кроме того, приборы различаются по внешнему виду, диапазону измерений, типу индикации. Выбрать наиболее подходящий индикатор можно, лишь разобравшись в классификации измерительных приборов. А в этом вам помогут представленные выше рекомендации!

2.4.23. Общие технические требования к указателям напряжения до 1000 В изложены в государственном стандарте.

2.4.24. В электроустановках напряжением до 1000 В применяются указатели двух типов: двухполюсные и однополюсные.

Двухполюсные указатели, работающие при протекании активного тока, предназначены для электроустановок переменного и постоянного тока.

Однополюсные указатели, работающие при протекании емкостного тока, предназначены для электроустановок только переменного тока.

Применение двухполюсных указателей является предпочтительным.

Применение контрольных ламп для проверки отсутствия напряжения не допускается.

2.4.25. Двухполюсные указатели состоят из двух корпусов, выполненных из электроизоляционного материала, содержащих элементы, реагирующие на наличие напряжения на контролируемых токоведущих частях, и элементы световой и (или) звуковой индикации. Корпуса соединены между собой гибким проводом длиной не менее 1 м. В местах вводов в корпуса соединительный провод должен иметь амортизационные втулки или утолщенную изоляцию.

Размеры корпусов не нормируются, определяются удобством пользования.

Каждый корпус двухполюсного указателя должен иметь жестко закрепленный электрод-наконечник, длина неизолированной части которого не должна превышать 7 мм, кроме указателей для воздушных линий, у которых длина неизолированной части электродов-наконечников определяется техническими условиями.

2.4.26. Однополюсный указатель имеет один корпус, выполненный из электроизоляционного материала, в котором размещены все элементы указателя. Кроме электрода-наконечника, соответствующего требованиям п. 2. 4.25, на торцевой или боковой части корпуса должен быть электрод для контакта с рукой оператора.

Размеры корпуса не нормируются, определяются удобством пользования.

Индикация наличия напряжения может быть ступенчатой, подаваться в виде цифрового сигнала и т.п.

Световой и звуковой сигналы могут быть непрерывными или прерывистыми и должны быть надежно распознаваемыми.

Для указателей с импульсным сигналом напряжением индикации является напряжение, при котором интервал между импульсами не превышает 1,0 с.

2.4.28. Указатели напряжения до 1000 В могут выполнять также дополнительные функции: проверка целостности электрических цепей, определение фазного провода, определение полярности в цепях постоянного тока и т.д. При этом указатели не должны содержать коммутационных элементов, предназначенных для переключения режимов работы.

Расширение функциональных возможностей указателя не должно снижать безопасности проведения операций по определению наличия или отсутствия напряжения.

2.4.34. При проверке отсутствия напряжения время непосредственного контакта указателя с контролируемыми токоведущими частями должно быть не менее 5 с.

Указатели напряжения — переносные приборы, предназначенные для проверки наличия или отсутствия напряжения на токоведущих частях. Такая проверка необходима, например, при работе непосредственно на отключенных токоведущих частях, при контроле исправности электроустановок, отыскании повреждений в электроустановке, проверке электрической схемы и т.п.

Во всех этих случаях требуется установить лишь наличие или отсутствие напряжения, но не его значение, которое, как правило, известно.

Все указатели имеют световой сигнал, загорание которого свидетельствует о наличии напряжения на проверяемой части или между проверяемыми частями. Указатели бывают для электроустановок до 1000 В и выше.

Указатели, предназначенные для электроустановок до 1000 В, делятся на двухполюсные и однополюсные.

Двухполюсные указатели требуют прикосновения к двум частям электроустановки, между которыми необходимо определить наличие или отсутствие напряжения. Принцип их действия — свечение неоновой лампочки или лампы накаливания (мощностью не более 10 Вт) при протекании через нее тока, обусловленного разностью потенциалов между двумя частями электрической установки, к которым прикасается указатель. Потребляя малый ток — от долей до нескольких миллиампер, лампа обеспечивает устойчивый и четкий световой сигнал, излучая оранжево-красный свет.

После возникновения разряда ток в цепи лампы постепенно увеличивается, т.е. сопротивление лампы как бы уменьшается, что в конце концов приводит к выходу лампы из строя. Для ограничения тока до нормального значения последовательно с лампой включается резистор.

Двухполюсные указатели могут применяться в установках как переменного, так и постоянного тока. Однако при переменном токе металлические части указателя — цоколь лампы, провод, щуп могут создать емкость относительно земли или других фаз электроустановки, достаточную для того, чтобы при касании к фазе лишь одного щупа указатель с неоновой лампочкой светился. Чтобы исключить это явление, схему дополняют шунтирующим резистором, шунтирующим неоновую лампочку и обладающим сопротивлением, равным добавочному резистору.

Однополюсные указатели требуют прикосновения лишь к одной — испытуемой токоведущей части. Связь с землей обеспечивается через тело человека, который пальцем руки создает контакт с цепью указателя. При этом ток не превышает 0,3 мА.

Изготовляются однополюсные указатели обычно в виде автоматической ручки, в корпусе которой, выполненном из изоляционного материала и имеющем смотровое отверстие, размещены сигнальная лампочка и резистор; на нижнем конце корпуса укреплен металлический щуп, а на верхнем — плоский металлический контакт, которого пальцем касается оператор.

Однополюсный указатель может применяться только в установках переменного тока, поскольку при постоянном токе его лампочка не горит и при наличии напряжения. Его рекомендуется применять при проверке схем вторичной коммутации, определении фазного провода в электросчетчиках, ламповых патронах, выключателях, предохранителях и т. п.

При пользовании указателями напряжения до 1000 В можно обходиться без защитных средств.

Правила техники безопасности запрещают применять вместо указателя напряжения так называемую контрольную лампу — лампу накаливания, ввернутую в патрон, заряженный двумя короткими проводами. Это запрещение вызвано тем, что при случайном включении лампы на напряжение большее, чем она рассчитана, или при ударе о твердый предмет возможен взрыв ее колбы и, как следствие, ранение оператора.

Указатели для электроустановок напряжением выше 1000 В, называемые также указателями высокого напряжения (УВН), действуют по принципу свечения неоновой лампочки при протекании через нее емкостного тока, т.е. зарядного тока конденсатора, включенного последовательно с лампочкой. Эти указатели пригодны лишь для установок переменного тока и приближать их надо только к одной фазе.

Конструкции указателей различны, однако всегда УВН имеют три основные части: рабочую, состоящую из корпуса, сигнальной лампы, конденсатора и пр, изолирующую, обеспечивающую изоляцию оператора от токоведущих частей и изготовляемую из изоляционных материалов, рукоятку, предназначенную для удержания указателя.

При пользовании УВН необходимо применять диэлектрические перчатки. Каждый раз перед применением УВН необходимо произвести наружный осмотр его, чтобы убедиться в отсутствии внешних повреждений и проверить исправность его действия, т.е. способность подавать сигнал.

Такая проверка производится путем приближения щупа указателя к токоведущим частям электроустановки, заведомо находящимся под напряжением. Проверка исправности может производиться и с помощью специальных источников высокого напряжения, а также с помощью мегомметра и, наконец, путем приближения щупа указателя к свече зажигания работающего двигателя автомобиля или мотоцикла.

Запрещается заземлять указатели, поскольку они и без заземления обеспечивают достаточно четкий сигнал, к тому же заземляющий провод может, прикоснувшись к токоведущим частям, явиться причиной несчастного случая.

В отдельных ситуациях, когда емкость указателя относительно заземленных предметов оказывается весьма малой (например, при работах на деревянных опорах воздушных линий электропередачи), указатель напряжения должен быть заземлен.

Для начала монтажных или ремонтных работ на электрических станциях и проводах нужно обязательно проверить показатели сети, отсутствие тока или его параметры. Для этого используется указатель напряжения, который может определить наличие вольтажа и его совпадения до 1000в.

Описание и принцип работы

Указатель высокого напряжения и низкого – это универсальный прибор переносного типа, предназначенный для определения напряжения на токоведущих проводах или клеммах отдельных электрических устройств (УВН 10, УНК, УВНК-10, BN-020022 Profipol Benning и прочие).

Данное приспособление необходимо при работе на различных предприятиях или выезде электромонтажников на объект. Главным отличием этого указателя от стандартных измерителей является то, что он поможет определить только наличие нагрузки, но не её показатели, в отличие от моделей, которые устанавливаются на дин-рейку.

Фото – индикатор с цифровым дисплеем

В основном сейчас используются только устройства напряжения до 1000 Вольт, такой указатель может быть двухполюсный и однополюсный, у них схожая схема, но разные области применения. Во время работы устройства с двумя полюсами нужно подключать к двум токоведущим жилам или контактам, в то время как однополюсный только к одной. Следует знать, что двухполюсные указатели более точные, поэтому они называются высоковольтные и применяются во время сложных работ.

Фото – УН ПИН-90

Помимо этого также есть бесконтактный указатель. Проверка с его помощью проводится без подключения к токоведущим клеммам. Это значительно увеличивает безопасность во время определения напряжения. Устройство оснащено цифровой индикацией, причем на ней отмечается не только наличие вольтажа, но и приблизительный размер благодаря магнитному полю.

Фото – однополюсная модель

Бывают переносные модели на батарейках и варианты, требующие подключения к сети (например, указатель или индикатор напряжения типа Контакт 55ЭМ, УВНУ-10 кВ СЗИП, ЭЛИН-1-СЗ ВЛ). В первом случае питание осуществляется при помощи двух или более батареек, реже от аккумулятора (это УВНК, УННО, УНК, ЭИ-9000/1, Duspol digital LC, Ратон). Это позволяет использовать прибор на местности, при выезде или на ремонтных работах вдали от рабочей сети электропитания.

Фото – импортный УН DT-9902

Принцип работы прибора довольно простой. Во время подключения к сети (при помощи соединения с токоведущими частями) производится сравнение потенциалов. Это повышает или понижает сопротивление в резисторах указателя. Из-за этого индикатор, который потребляет самые малые доли ампер, протекающих в проводах или клеммах, загорается либо издает звуковой сигнал. Если при работе индикатор молчит – то нагрузки нет. В отдельных случаях наблюдается планомерное затухание сигнала – это значит, что в проводах была остаточная энергия.

Требования к указателям напряжения ГОСТ 20493-2001:

У приборов до 1000 Вольт обязательно нагрузка индикаторов должно быть не выше 90 В;
Однополюсное устройство находится в одном корпусе, в то время как двухполюсное располагается в двух, соединенных между собой шнуром;
Любой указатель наличия нагрузки (бортовой, комби и прочие) должны иметь три поверхности: рабочую, изолированную, определяющую и держатель;
В отдельных моделях рабочая часть соединяется с индикатором;
Поверка указателей производится каждый раз перед использованием при помощи напряжения 2 кВ, при этом она длиться не более минуты.

Нужно помнить, что инструкция по безопасности требует полной подготовки перед использованием аппарата. В частности, необходимо надеть энергокомплект, включающий диэлектрические перчатки и ботинки. Эти требования указаны для электрического прибора, и они отличаются от моделей индикаторов в УАЗ, ВАЗ и прочих авто, судов и т. д.

Видео: UT 15В индикатор напряжения

Технические характеристики

Указатели напряжения для фазировки обязательно имеют сертифицированные параметры качества. Они зависят от конкретной модели прибора, рассмотрим данные на примере УННУ-40-1000:

Двухполюсный указатель рабочего напряжения типа УНН Комби имеет параметры аналогичные УННДП 12 660 (кроме максимального напряжения 660 В и рабочих температур до +35):

Фото – УНН Комби

Схожие технические характеристики имеет двухполюсный указатель напряжения УНН 1, ПИН 90, УНК 04, Лоцман-2 и УВНИ 150 А. Их паспорт качества отличается лишь по данным нагрузки и сроку эксплуатации.

Фото – УН Лоцман-2

Параметры однополюсного УВН 80:

Технические данные однополюсного УВНБУ 6–35:

Очень интересная модель УНВЛ-0,4 используется в основном на воздушных линиях электропередач. У него следующие параметры:

Помимо этого, все модели имеют гарантию год, но только при условии регулярной проверки перед началом работы. При покупке всегда обращайте внимание на наличие данных ГОСТ, сертификата и соответствия качества и возможности проверку перед приобретением. Каждые полгода нужно производить калибровку датчика на специальном оборудовании.

Его особенностью является то, что рабочий контакт выполнен в виде крюка, который цепляется на провод независимо от высоты. Сейчас в продаже есть более новая модель для определения напряжения – это указатель УВНУ-10ФБ Поиск 1, где за крепление контактов на токоведущих частях проводов или машин отвечает штанга. Пользоваться прибором этого типа очень просто – высота регулируется при помощи ручных манипуляций, кроме того, можно зафиксировать длину выдвигающейся части.

Фото – УВНУ-10ФБ Поиск 1

Купить указатель напряжения можно в любом городе в специализированных электрических магазинах, но цена будет зависеть от того, кто производитель и типа прибора. Двухполюсные устройства дороже, чем однополюсники. Стоимость также варьируется от города покупки. Например, в Москве определенный УН может стоить выше, чем в Екатеринбурге или Новосибирске.

Некоторые работы в доме могут выполнять люди без специальной подготовки, не прибегая к услугам профессиональных электриков. Замена розеток, выключателей, ремонт настольных и потолочных светильников не требуют высокой квалификации.

Но, выполняя эти работы, нужно соблюдать правила безопасности, которые требуют проверять отсутствие напряжения на контактах электроприборов перед началом работ.

Однополюсный указатель напряжения – самый простой и доступный каждому прибор, показывающий наличие или отсутствие «фазы». Некоторые модели применяются и для поиска мет обрывов в проводах, шнурах и кабелях. Так как некоторые однополюсные указатели совмещают в себе функцию простенькой отвертки, их называют «индикаторными отвертками», а иногда – просто «индикаторами».

Достоинство индикаторов – для их работы не требуется второго провода. Они используют ток, проходящий от «фазы» к «земле» через указатель и тело человека, соединенные последовательно. Для человека этот ток не представляет опасности. Ему не препятствуют ни сопротивление обуви, ни материал пола, но пользоваться указателем в диэлектрических перчатках нельзя, работать он не будет. На практике были единичные случаи, когда индикаторная отвертка не определила наличие «фазы» в светильнике, если электрик стоял на сухой деревянной стремянке.

Виды указателей напряжения

Индикаторы напряжения бывают:

с неоновой лампой;
со светодиодами, работающие от батареек;
с жидкокристаллическим дисплеем;
бесконтактные;
многофункциональные.

Указатели с неоновыми лампами – самые дешевые . Их недостатки – малое напряжение зажигания и недостаточная яркость свечения. При ярком освещении их приходится прикрывать рукой, чтобы увидеть, светится ли лампа.

У светодиодных индикаторов порог зажигания меньше. Наличие батарейки позволяет выполнять с их помощью «прозвонку» цепей и использовать указатель, как бесконтактный. Если взяться за жало индикаторной отвертки и поднести ее торец с проводу, находящемуся под напряжением, лампочка загорится. Но, если она не загорится, это не будет доказательством отсутствия напряжения.

Недостаток светодиодных указателей – они светятся от наводок в проверяемой цепи, показывая «фазу» там, где ее нет.

Общий недостаток неоновых и светодиодных указателей – наличие пружинки, которая со временем ослабевает. Контакт внутри индикатора нарушается, и он перестает работать.

Этого недостатка лишены индикаторы с дисплеями и бесконтактные указатели напряжения. У индикаторов с дисплеями та же чувствительность, что и у светодиодных. Но они распознают наводки в цепях, указывая на дисплее значение напряжения ниже, чем 220В. Зато их показания не видно в темноте.

Бесконтактные указатели работают от батареек. Если их включить и поднести к фазному проводнику, они издают световой и звуковой сигналы. Это удобно при проверке полного отсутствия напряжения, но неприменимо в случаях определения «фазы» на проводниках, находящихся близко друг к другу. Для этого нужен контактный указатель.

Многофункциональные индикаторы представляют собой мультиметр, совмещающий функции омметра, вольтметра и бесконтактного указателя.

Каждый из указателей имеет недостатки и достоинства. Выбирая индикатор напряжения для собственных нужд, помните: хороший указатель – это тот, которым Вы. Главное – научиться верно понимать сигналы указателя.

Как пользоваться указателем напряжения?

Каждый раз перед началом работы с индикатором напряжения надо:

осмотреть прибор, убедиться в целостности корпуса;
прикоснуться к «фазе» и удостовериться, что прибор показывает ее наличие.
после проверки отсутствия напряжения в месте работы нужно повторить проверку исправности .

Такая последовательность действий указателя в ходе проверки. Ее придерживаются и профессиональные электрики при работе в промышленных электроустановках.

Не забывайте специального контакта на корпусе прибора при проверке. Иначе указатель работать не будет.

Индикатор напряжения ПИН-90-М ( 121102-00118 )

Загрузка данных

Номенклатурный номер: 121102-00118 Скопировано в буфер обмена

Описание

Задать вопрос

Индикатор напряжения ПИН-90-М предназначен для определения наличия напряжения в электроустановках постоянного и переменного тока, от 50 до 1000В

Центральный склад: 142001, г. Домодедово, ул.Промышленная д.13, Режим работы: Понедельник-Пятница: с 8:00 до 19:00 (суббота, воскресенье выходной)

Удаленный склад: 115088, г.Москва, ул. Южнопортовая д.7А, Режим работы: Понедельник-Пятница: с 8:00 до 17:00 (суббота, воскресенье выходной)

Срок поставки: Срок поставки между складами с момента подтверждения оплаты может варьироваться от 2 до 3 дней.

Прогнозируемый срок поставки не учитывает сезонность, загруженность производства и заказываемое количество. Данный срок носит информационный характер и является средним значением выполнения заказов на данное изделие за последние 12 месяцев.

Важно: Точный срок поставки согласовывается в спецификации.

Региональный склад: 630110, г.Новосибирск, ул. Богдана Хмельницкого, 93 ст.6, Режим работы: Понедельник-Пятница: с 8:00 до 17:00 (суббота, воскресенье выходной). Тел.: +7 (383) 312-04-34

Указатели напряжения до 1 кВ промышленного изготовления

Подробности: Категория: Средства защиты

Примечания: 1. Для указателей ИН-92 и ПИН-90 в числителе указано рабочее напряжение на переменном токе, в знаменателе — на постоянном; в скобках (для ИН-92) указаны размеры щупа с контактом.

Длина соединительного провода для указателя УН-1 0,6 м, МИН-1 0,64 м, ПИН-90 0,8 м, УНН-10, ИН-92, УННУ-1 и УНН 1 м и УННЛ-1 1,1 м.
Напряжение зажигания указателя ПИН-90 не более 50 В, остальных типов — не более 90 В.
Размеры двухполюсных указателей приведены для развернутого состояния указателя.

Таблица 2. Указатели и сигнализаторы напряжения свыше 1 кВ промышленного изготовлении

Примечания:

Расшифровка буквенной части обозначения: УВН — указатель высокого напряжения (Ф — для фазировки, Б — бесконтактный, У — универсальный), СН — сигнализатор напряжения (И — индивидуальный, С — стационарный), СОН — сигнализатор опасного напряжения.
В числителе — габариты в рабочем состоянии, в знаменателе — в транспортном положении (в чехле).
Указатель УВН-80М заменяется указателем УВНУ.
Указатель УВНУ комплектуется трубкой фазировки ТФ-10, в рукоятку указателя встроено устройство проверки указателя ПН-0,1.
Напряжение зажигания указателя УВН-90 9 кВ, УВНУ 1,5 — 7,6 кВ (при 6 кВ) и 2,7—12,7 кВ (при 10 кВ) соответственно для встречного и согласного включения, УВНФ 20—40 кВ (при 35 кВ) и 50 — 100 кВ (при 110 кВ) соответственно для встречного н согласного включения; для остальных указателей 6—10 кВ напряжение зажигания 0,55 кВ. Для указателя УВНБ и сигнализаторов напряжения минимальное расстояние между рабочей и токоведущей частями, находящимися под напряжением 6 кВ, не менее 50 мм для УВНБ, 1,4 м для СНИ и 0,4 м для СНС-1.
Для проверки указателей напряжения может использоваться приспособление ППУ, изготовленное СКТБ ВКТ Мосэнерго по ТУ 34-28-10032 —80: габариты 114 x 70 x 40 мм, масса 230 г, напряжение на выходе 600-800 В.

Однополюсные индикаторы напряжения. Как пользоваться индикаторной отверткой

С электричеством нужно быть на Вы!!! (мудрость, проверенная временем).

Многие, наверное, слышали, что настоящий электрик не тот, что не боится электричества, а тот, который способен избежать прямого контакта с электричеством. По статистике, от поражения электрическим током, погибают чаще всего электрики со стажем от десяти и более лет. Именно в этом возрасте притупляется чувство опасности. Некоторые электрики со стажем проверяют наличие электричества на ощупь, да-да, именно на ощупь. Но зачем рисковать жизнью собственной, когда есть приборы, показывающие наличие напряжения?

Приборов показывающих наличие напряжения достаточно много — от самого простого индикатора напряжения на газоразрядной лампочке (неонке) и заканчивая приборами показывающими не только наличие напряжения но и множество других параметров.

В данной статье мы рассмотрим индикаторы и указатели напряжения , которые чаще всего используют в своей практике, как профессиональные электрики, так и домашние мастера. В электроустановках чаще всего применяются указатели с сигнальными лампами.

Относительно недавно у нас появились индикаторы напряжения, позволяющие обнаружить наличие напряжения без прямого контакта с токоведущим проводником.

Примером данного типа приборов служит индикатор китайского производства (хоть везде и пишется, что сделано в Германии) — MS-18, MS-58 и.т.д.

Состоят такие индикаторы из светодиода, двух миниатюрных батареек и пары радиодеталей. Такими индикаторами можно безопасно пользоваться, имея достаточно опыта и знаний в электричестве, так как индикаторы эти реагируют на все подряд. Начинающим электрикам и людям без опыта, использовать данные пробники нежелательно и даже опасно.

Двухполюсный указатель напряжения состоит из неоновой лампы, добавочного сопротивления и контактов 1. Неоновая лампа , чтоб не возникало свечения под действием емкостного тока. Элементы указателя закреплены в двух пластмассовых корпусах 2, соединенных гибким проводом 3 длиной 1 м с изоляцией повышенной надежности.

Двухполюсные указатели требуют прикосновения к двум точкам электроустановки, между которыми необходимо определить наличие или отсутствие напряжения.

Разновидностей таких индикаторов достаточно много. По функционалу они тоже отличаются.

Самые простые индикаторы показывают только наличие напряжения. Примером такого индикатора можно назвать приборы серии ПИН-90 (-2м, -2му), УН500,-453, УННУ-1, УНН-10, МИН-1 и т.д. Более продвинутые модели — серии ЭЛИН-1 (-СЗ, -С3 ИПМ, -С3 Комби) и многие другие приборы, показывают не только наличие напряжения на исследуемом участке цепи, но еще и его номинал, полярность напряжения.

В качестве индикации используются: неоновые лампочки, светодиоды различных цветов, цифровые и индикаторы. Также существуют и комбинированные индикаторы, где наряду со световой индикацией присутствует и звуковая, что делает работу с приборами более комфортной и безопасной.

В отличие от однополюсных указателей и индикаторов, для того чтобы узнать о наличии напряжение данными (двуполюсными) приборами, необходимо использование двух щупов. Применение таких приборов дает более полную картину о наличии или отсутствии напряжения, что, несомненно, очень важно в работе электриков.

Кроме проверки на наличие или отсутствия напряжения на участке исследуемой цепи, некоторые двуполюсные индикаторы можно использовать в качестве «прозвонки», то есть, проверить цепь на обрыв.

Также достаточно популярны среди электриков цифровые приборы — . Эти универсальные приборы позволяют проверить напряжение, сопротивление и т.д. В качестве индикации используется цифровое табло, звуковая и световая индикация.

Некоторые модели оснащены , не нарушая изоляции проводника. Также многие модели тестеров комплектуются термодатчиком, при помощи которого можно измерить температуру оборудования — трансформаторов, двигателей, силовых ключей.

Предостережения:

1. Использовать в качестве указателя напряжения контрольную лампу (обычный патрон с двумя выводами) в сетях с линейным напряжением больше 220 В не разрешается, так как при ошибочном включении на линейное напряжение в сети 380/220 В лампа взрывается и осколки могут ранить работающего.

2. В практике часто изготовляют однополюсные указатели напряжения своими силами, обычно в виде отвертки. При этом бывают случаи неправильного изготовления, и тогда возникает опасность поражения током. Нельзя делать стержень отвертки длиной более 20 мм. Если стержень длинный, возникает опасность прикосновению к нему во время проверки напряжения. Желательно плотно натягивать на стержень изолирующую трубку, оставляя неизолированным участок длиной не более 5 мм. Со стороны, близкой к источнику напряжения, обязательно должно быть упорное кольцо, выступающее на 3-4 мм, чтобы не допустить соскальзывания руки.

Особое внимание нужно уделить выбору неоновой лампочки, чтоб порог зажигания не превышал 90 В. Наиболее подходит лампа типа ИН-3. Добавочное сопротивление должно быть не менее 200 кОм.

Корпус следует изготовлять из эбонита или пластмассы темного цвета, при котором легче заметить свечение лампочки. Изготовленные указатели следует обязательно испытать.

В любом случае, используя индикаторы и указатели напряжения, необходимы знания и навыки при работе с ними. Также не стоит забывать и о технике безопасности. И, доверяйте профессионалам, электричество, как известно, шуток и ошибок не прощает!

Электричество является непременным атрибутом современной жизни. Уже трудно себе представить дом без всяких бытовых приборов, которые обеспечивают комфорт и облегчают хозяйке домашние хлопоты. Но в то же время большое количество мощных потребителей негативно сказывается на электрической проводке. Часто случаются мелкие неисправности, например, стала искрить розетка, выключатель или другие поломки. Каждый раз вызывать квалифицированного электрика накладно, да и большинство подобных поломок легко можно устранить самостоятельно. Для правильного подключения бытовых приборов и дополнительной безопасности работы с электропроводкой нужно определить не только фазу, но и ноль. Чаще всего для этого используется пробник напряжения в виде отвертки. О том, как пользоваться индикаторной отверткой и поговорим сегодня.

Индикаторная отвертка — принцип действия и виды .
Сегодня в виде обычной отвертки выпускается большое количество индикаторов напряжения. Все они имеют общий принцип работы, но могут отличаться устройством и формой исполнения. Условно такие индикаторы делятся на три группы. Рассмотрим их более подробно.

Простая индикаторная отвертка

Устройство обычного пробника в виде отвертки достаточно простое:
Жало выступает в роли проводника;
К нему подключен тиристор, понижающий силу тока до безопасной для человека величины;
Затем расположен светодиод, который соединен с контактным элементом, выведенным на торец отвертки;
Корпус выполнен из прозрачного пластика, который позволяет видеть, когда светодиод загорается.

Такую конструкцию имеет самый простой и дешевый пробник напряжения, который позволяет определить только рабочую фазу. Ноль этой отверткой можно найти методом исключения. Для того чтобы найти фазу в проводах с помощью индикаторной отвертки, нужно поступить следующим образом:
Жалом отвертки поочередно касаются ко всем проводам контактной группы: розетки, выключателя или обрыва в проводке. При этом нужно пальцем (удобнее большим) прикасаться к контактной пластине, которая выведена на корпус;
При прикосновении к фазе, индикатор начнет светиться, а ноль свечение диода не вызывает.

Таким нехитрым способом индикатор показывает, где фаза или ноль в проводах или розетке. После этого можно правильно сделать подключение бытового прибора, для которого важно соблюдать полярность.

Обратите внимание! Такие работы проводятся при включенном автомате на щитке. Если необходимо определить фазу на концах проводов, их предварительно нужно зачистить и развести в стороны, чтобы не вызвать короткое замыкание.

Индикаторная отвертка с батарейкой

Принцип работы, внешний вид и устройство такого пробника напряжения ничем не отличается от вышеописанной отвертки. Отличием является наличие двух или трех батареек «таблеток», скрытых в ручке. Этот прибор является более универсальным и позволяет выполнить такие действия:

Найти фазу и ноль в проводах под напряжением;
Определить обрыв в обесточенной цепи. Для этого одного конца провода нужно коснуться рукой, а другой — щупом отвертки. Если цепь не нарушена, индикатор загорится. При обрыве в проводке, индикатор напряжения ничего не покажет;
Кроме этого, такой инструмент за счет приведенного магнитного поля показывает расположение скрытой проводки. Для этого отвертка пальцами берется за жало, а ручкой ведется вдоль стены. При обнаружении запитанной проводки светодиод загорится.

Совет. Такая особенность данного устройства очень полезна в случае, когда необходимо проверить стену и определить расположение проводки перед сверлением отверстия.

Универсальная индикаторная отвертка

Такое устройство отверткой называют больше по привычке, скорее это мини-тестер. Работает инструмент от батареек, а внешний вид сильно отличается от предыдущих вариантов. На передней панели прибора располагается два светодиода (красный и зеленый), также в зависимости от модели может быть небольшой дисплей, на который выводится показатель измеренного напряжения.

Индикатор имеет кнопку выбора режима измерения. Рассмотрим принцип и назначение различных режимов:
Режим O применяется для того, чтобы найти фазу контактным способом. При наличии напряжения на проводнике, загорается красный светодиод;
В режиме L прибор работает при пониженной чувствительности. Этот режим позволяет бесконтактно определить наличие напряжения в скрытой проводке глубиной залегания до 1,5 см. При обнаружении электромагнитного поля загорается зеленый светодиод и раздается писк зуммера;
Положение H обозначает режим высокой чувствительности. Этот режим позволяет найти фазу и ноль (подключенной проводки) на глубине до 3 см.

Также это устройство позволяет провести проверку цепи на разрыв, измерить сопротивление до 100 МОм, можно определить полярность, и измерить напряжение источника постоянного тока до 36 В. Этот прибор пригодится в качестве домашнего тестера: он позволяет проверить работоспособность лампы или другого электрического прибора с замкнутой цепью. Можно проверить любой нагревательный прибор, например, тен или камин при пробое на корпус.

две фазы
Разобравшись, как пользоваться индикаторной отверткой, хотелось бы рассказать об интересной неисправности в электрической сети. Бывает так, что во время проверки, например, розетки, пробник определяет фазу на обоих проводах. В этом случае не пугайтесь, ничего страшного не произошло. Скорее всего, просто пропал ноль, а фаза по замкнутой цепи пошла дальше, потому тестер и определяет ее на обоих проводах. Рассмотрим вероятные места, где мог пропасть ноль и причины, по которым это произошло:

1. Наиболее распространенным местом обрыва нулевого провода является подъездной щиток. Практически всегда он находится в общем доступе, и проводов там намотано много. Поэтому прежде всего нужно проверить свой вывод на щитке, разобрать, зачистить место подключения и заново прикрутить ноль;
2. Второй распространенной причиной является выбитый автомат или пробка на счетчике в самой квартире. Причиной этого могла стать повышенная перегрузка. Стоит отметить, именно потому, что это приводит к появлению фазы на обоих проводах, по новым требованиям ПУЭ установка автоматического размыкателя на нулевом проводе запрещена;
3. Часто ноль «теряется» в распределительной коробке, расположенной в комнате. Причина — слабый контакт и повышенная нагрузка;
4. В частных домах кабель могут повредить мыши. Причем до сих пор непонятно, чем грызунов привлекает изоляция, но факт остается. Поэтому в коттеджах не рекомендуется прокладывать открытую проводку, особенно на чердаке и под полом. Все провода должны быть уложены в штробы или дополнительно защищены;
5. Сверление стен — один из факторов, который может повлечь за собой обрыв провода. Поэтому профессиональные электрики перед подобными работами всегда рекомендуют проверять место сверления с помощью индикатора скрытой проводки.

подводим итоги
В заключение отметим, что пробник должен быть в любом доме. Это может быть как простая индикаторная отвертка или дорогой электронный вариант: каждый выбирает по возможностям и потребностям. Сложности в их использовании нет никакой: при правильной эксплуатации вероятность поражения током полностью исключена.

Вы, наверное, не раз видели индикатор напряжения в форме ручки. Его удобно носить в нагрудном кармане рубашки или спецовки. Некоторые современные модели таких индикаторов могут обнаружить напряжение даже без металлического контакта с токоведущим проводником. Этому виду электрозащитных средств и посвящена наша статья.

Терминология

В многочисленных статьях, размещенных в Сети, можно встретить термины «указатель напряжения», «указатель низкого напряжения», «индикатор напряжения». При этом зачастую никакого разграничения между областями их использования не приводится, а иногда они даже отождествляются. Попробуем разобраться в этом вопросе.

Многочисленные правила применения электрозащитных средств, которые постоянно изменяются и переиздаются, всегда оперируют термином «указатель напряжения». При этом все подобные приборы разделяются на двухполюсные, состоящие из двух корпусов, соединенных гибким изолированным проводником; и однополюсные, содержащие один корпус. Первые работают на активном токе, протекающем через оба корпуса, а вторые — на емкостном, протекающем через тело пользователя.

Широко используемый в обиходе термин «индикатор напряжения» относится именно ко второму типу указателей. Их ранние модели выпускались в виде отвертки с индикатором-лампочкой в рукоятке. Современные устройства больше похожи на строительный маркер (правда, с металлической контактной частью на конце).

Несколько слов об окружающих нас емкостях

Как работает емкостный индикатор напряжения? Чтобы понять это, давайте вернемся на мгновение к электрической теории цепей и вспомним, как функционирует конденсатор. Он имеет два проводника, или пластины, разделенные диэлектриком. Многие думают, что конденсаторы — это отдельные элементы электронных схем, но в действительности мир заполнен конденсаторами, присутствия которых мы обычно просто не замечаем. Вот пример. Предположим, что вы стоите на ковре, покрывающем бетонный пол прямо под горящим светильником с напряжением 220 В. Хотя вы этого и не ощущаете, но ваше тело проводит очень небольшой (порядка микроампера) переменный ток, так как оно является частью цепи, состоящей из двух последовательно включенных конденсаторов. Двумя пластинами первого конденсатора являются нить накала в электролампочке и ваше тело. Диэлектриком — воздух (и, возможно, ваша шляпа) между ними. Пластинами второго конденсатора являются ваше тело и бетонный пол (он достаточно хороший проводник).

Диэлектрик второго конденсатора — это ковер плюс ваши ботинки и носки. Поскольку бетонный пол хорошо заземлен, как и нулевой провод питающей сети, к цепи из двух этих последовательных конденсаторов приложено напряжение в 220 В.

А где же здесь индикатор напряжения?

Понимание того, как напряжение сети делится между двумя последовательными конденсаторами, имеет решающее значение для выяснения, как работает емкостной индикатор.

Вернемся к теории электрических цепей. В последовательной цепи напряжение будет распределяться по величине сопротивления (закон Ома). У конденсатора, чем меньше его емкость, тем больше так называемое емкостное сопротивление переменному току. Таким образом, когда два конденсатора соединены последовательно, наибольшая доля приложенного к ним напряжения будет падать на меньшем приборе.

В приведенном выше примере только несколько вольт находится между ногами и полом (на большой емкости), а остальная часть из 220 В приложена между вашей головой и нитью накала лампочки (к меньшей емкости). Теперь, если вы держите большой палец на контактной площадке на торце рукоятки емкостного индикатора и прикасаетесь им к оголенному участку провода, питающего светильник, то вместо малой емкости в цепь протекания емкостного тока оказывается включенной чувствительная к малым токам схема индикатора напряжения. Ток этот, конечно, возрастает, но высокоомный резистор внутри индикатора ограничивает его до неопасной величины. В результате протекания тока в индикаторе светится неоновая лампа или светодиод либо звучит зуммер.

Традиционный емкостный индикатор

Индикаторы напряжения сети в виде отвертки, показывающие, на какой контактный штырек электророзетки выведена фаза, а на какой — нуль, появились еще в 60-х годах прошлого века. Их электросхема включает последовательно соединенные металлическое щуп-жало, высокоомный резистор в диапазоне сопротивлений от 0,47 до 1 МОм с малой собственной емкостью между его выводами (например, типа МЛТ-1,0, ВС-0,5, МЛТ-2,0), неоновую лампочку и контактную площадку на торце рукоятки. При касании жалом отвертки «фазного» проводника и замыкании цепи емкостного тока через контактную площадку и тело пользователя неоновая лампочка светится, что является признаком напряжения в рабочем диапазоне индикатора от 90 до 380 В (иногда — от 70 до 1000 В) при частоте тока 50 Гц.

Почему именно неоновая лампочка?

Можно ли ее заменить на другой индикатор? Долгое время считалось, что нет. Действительно, при емкости человеческого тела порядка сотен пФ и напряжении U = 220 В максимальный емкостной ток частотой f = 50 Гц через него на «землю» составляет U/(1/ωC) = U2πfC = 220 х 6,28 х 50 х n100 пФ = n7 мкА. А чтобы засветился светодиод, через него должен пройти ток порядка миллиампера. Тем не менее, были найдены особые схемные решения, позволившие создать индикатор напряжения на светодиодах, пьезокерамических зуммерах и других элементах индикации.

От неоновой лампочки к светодиоду

Решение состояло в изменении самого режима свечения с непрерывного на импульсный. Если попробовать оценить мощность, потребляемую неоновой лампой, то при напряжении 100 В и емкостном токе 20 мкА она составит 100 х 20 мкА = 2 мВт. Если подводить такую мощность к светодиоду в течение интервала времени, например, 10 мс, а не целую секунду, то он на этом интервале вполне хорошо засветится. Ведь при напряжении 100 В ток через него составит 0,002 Вт х 100/100 В = 0,002 А = 2 мА.

Если обеспечить накопление энергии в некоторой схеме (например, в релаксационном генераторе) в течение долей секунды, а затем — резкий ее сброс на светодиод за 10 мс, то последний будет периодически ярко вспыхивать. Получится светодиодный индикатор напряжения без встроенной батарейки.

Каким путем пошли в Китае?

Китайские разработчики решили, что раз светодиоду для непрерывного свечения требуется постоянный ток порядка нескольких миллиампер, то нужно встроить в индикатор пальчиковую батарейку (или две). При этом ток через светодиод открывает простейший транзисторный ключ, управляемый емкостным током через тело пользователя.

Упростилась ли схема? В общем-то, да, но она стала чрезвычайно чувствительной к разного рода наводкам. Поэтому надежность показаний таких индикаторов под вопросом.

Индикатор напряжения цифровой

Свечение неоновой лампочки или светодиода, конечно, надежный способ индикации наличия напряжения, но уж слишком малоинформативный, если цепь имеет несколько уровней напряжения. В этом случае на помощь приходит бурно развившаяся в последние десятилетия измерительная электроника.

Самым простым способом придать индикатору большую информативность является введение в его схему нескольких компараторов напряжения, которые срабатывают при разных его уровнях. Выход каждого из компараторов управляет своим элементом индикации на корпусе прибора.

Настоящий же индикатор напряжения цифровой получается, если измеряемое напряжение оцифровывается на встроенном АЦП, а затем через специальную схему подается на семисегментные элементы индикации, способные отобразить цифры от 0 до 9, или на малогабаритный матричный цифровой индикатор. По такой схеме строятся дорогостоящие профессиональные индикаторы напряжения.

Применяемые во время эксплуатации и ремонтов электроустановок.

Сегодняшняя статья будет посвящена указателям низкого напряжения.

Указатели низкого напряжения (УНН) применяются для проверки наличия, либо отсутствия напряжения в электроустановках до 1000 (В) на тех токоведущих частях, где будут выполняться работы. Также УНН используют для проверки совпадения фаз, т.е. фазировки низковольтного .

Указатели низкого напряжения, или по-другому их еще называют указатели напряжения до 1000 (В) бывают 2 типов:

однополюсные
двухполюсные

Поэтому и применение будет зависеть от того, какой Вы указатель используете.

Существует большое количество разновидностей указателей низкого напряжения от различных производителей.

На каждом виде я останавливаться не буду, а расскажу только о самых распространенных и надежных указателях низкого напряжения, применяемых лично мною.

Например, однополюсный указатель низкого напряжения в виде индикаторной отвертки применяется в электроустановках только переменного тока напряжением от 100 (В) до 500 (В) и частотой 50 (Гц). Принцип действия такого указателя основан на протекании емкостного тока.

Двухполюсный указатель низкого напряжения (УНН-10К) имеет более широкое применение. Его можно использовать в электроустановках, как переменного тока напряжением от 110 (В) до 500 (В) и частотой 50 (Гц), так и постоянного тока напряжением от 110 (В) до 500 (В).

Его принцип действия основан на свечении газаразрядной лампы при протекании через нее активного тока.

Двухполюсный указатель низкого напряжения (ПИН-90М) использую ни чуть не реже. Его принцип действия и конструкция аналогична УНН-10К.

Разница заключается лишь в пределах контролируемого напряжения. У него рабочее напряжение находится в пределах от 50 (В) до 1000 (В).

испытание изоляции рукояток и проводов
испытание повышенным напряжением
определение напряжения индикации
измерение тока, проходящего через УНН при наибольшем рабочем напряжении

1. Испытание изоляции рукояток и проводов указателей низкого напряжения

Испытание изоляции рукояток корпусов и проводов указателей низкого напряжения проводится 1 раз в год по следующей принципиальной схеме:

Оба корпуса (рукоятки) двухполюсного указателя низкого напряжения заворачивают в фольгу. Соединительный провод опускают в ванну с водой, где температура воды должна находиться в пределах 10 — 40° С. Необходимо выдержать расстояние 0,8 — 1,2 (см) между водой и корпусами указателя.

Первый вывод от испытательного трансформатора соединяем к электродам-наконечникам. Второй (заземленный) вывод необходимо опустить в ванну с водой и соединить с фольгой.

Аналогично, проводят испытание изоляции корпуса (рукоятки) и у однополюсных указателей низкого напряжения. Корпус заворачивают в фольгу по всей длине. Необходимо выдержать расстояние 1 (см) между фольгой и электродом, находящимся на торцевой части указателя. Один вывод от испытательного устройства соединяем к электроду-наконечнику. Другой (заземленный) вывод — к фольге.

Для УНН с рабочим напряжением до 500 (В) испытательное напряжение 1000 (В) подается в течение 1 минуты.
Для УНН с рабочим напряжением до 1000 (В) испытательное напряжение 2000 (В) подается в течение 1 минуты.

2. Испытание указателей низкого напряжения повышенным напряжением

Испытание указателей низкого напряжения повышенным напряжением проводится следующим образом.

Испытательное напряжение величиной 1,1 от наибольшего рабочего напряжения УНН прикладывается между электродами-наконечниками у двухполюсных указателей, или между электродом-наконечником и торцевой частью у однополюсных указателей в течение 1 минуты.

3. Определение напряжения индикации

Напряжение от испытательного устройства плавно повышают, при этом фиксируя напряжение индикации указателя напряжения (УНН).

Указатели низкого напряжения должны иметь напряжение индикации не более 50 (В).

4. Измерение тока, проходящего через УНН при наибольшем рабочем напряжении

Напряжение от испытательного устройства плавно повышают до наибольшего рабочего напряжения 1000 (В), при этом фиксируют величину тока, протекающего через УНН.

У двухполюсных указателей напряжения величина тока не должна превышать 10 (мА).
У однополюсных указателей напряжения величина тока не должна превышать 0,6 (мА).

Как пользоваться указателем напряжения?

Перед применением и использованием указателя низкого напряжения, необходимо убедиться в его исправном состоянии, путем прикосновения к токоведущим частям электроустановки, находящимся заведомо под напряжением. Также необходимо проверить наличие штампа о проведении испытаний УНН.

Проверка отсутствия напряжения указателем низкого напряжения производится на токоведущих частях путем непосредственного контакта. Время контакта должно быть не менее 5 секунд.

При использовании однополюсного указателя низкого напряжения применение не допустимо, т.к. необходимо обеспечить контакт между электродом на торцевой части корпуса и пальцем человека.

P.S. На этом статью на тему указатель низкого напряжения я завершаю. Если у Вас возникли вопросы при изучении материала статьи, то прошу задавать их в комментариях. Не забывайте подписываться на новые статьи с сайта. Новость о выходе новой статьи будет приходить Вам прямо на почтовый ящик.

Испытание указателей напряжения до 1000 В

Описание товара:

Указатели напряжения до 1000В

Низковольтные указатели напряжения предназначены для определения наличия или отсутствия напряжения на токоведущих частях электроустановок.

В электроустановках напряжением до 1000 В применяются указатели двух типов: двухполюсные и однополюсные.

Применение двухполюсных указателей является предпочтительным.

Применение контрольных ламп для проверки отсутствия напряжения не допускается.

Двухполюсные указатели состоят из двух корпусов, выполненных из электроизоляционного материала, содержащих элементы, реагирующие на наличие напряжения на контролируемых токоведущих частях, и элементы световой и (или) звуковой индикации. Корпуса соединены между собой гибким проводом длиной не менее 1 м. В местах вводов в корпуса соединительный провод должен иметь амортизационные втулки или утолщенную изоляцию.

Размеры корпусов не нормируются, определяются удобством пользования.

Каждый корпус двухполюсного указателя должен иметь жестко закрепленный электрод-наконечник, длина неизолированной части которого не должна превышать 7 мм, кроме указателей для воздушных линий, у которых длина неизолированной части электродов‑наконечников определяется техническими условиями.

Однополюсный указатель имеет один корпус, выполненный из электроизоляционного материала, в котором размещены все элементы указателя. Кроме электрода-наконечника, соответствующего требованиям п. 2.4.25, на торцевой или боковой части корпуса должен быть электрод для контакта с рукой оператора.

Размеры корпуса не нормируются, определяются удобством пользования.

Напряжение индикации указателей должно составлять не более 50 В.

Индикация наличия напряжения может быть ступенчатой, подаваться в виде цифрового сигнала и т. п. Световой и звуковой сигналы могут быть непрерывными или прерывистыми и должны быть надежно распознаваемыми. Для указателей с импульсным сигналом напряжением индикации является напряжение, при котором интервал между импульсами не превышает 1,0 с.

Электрические испытания указателей напряжения до 1000 В состоят из испытания изоляции, определения напряжения индикации, проверки работы указателя при повышенном испытательном напряжении, проверки тока, протекающего через указатель при наибольшем рабочем напряжении указателя.

При необходимости проверяется также напряжение индикации в цепях постоянного тока, а также правильность индикации полярности. Напряжение плавно увеличивается от нуля, при этом фиксируются значения напряжения индикации и тока, протекающего через указатель при наибольшем рабочем напряжении указателя, после чего указатель в течение 1 мин. выдерживается при повышенном испытательном напряжении, превышающем наибольшее рабочее напряжение указателя на 10%.

При испытаниях указателей (кроме испытания изоляции) напряжение от испытательной установки прикладывается между электродами-наконечниками (у двухполюсных указателей) или между электродом-наконечником и электродом на торцевой или боковой части корпуса (у однополюсных указателей).

При испытаниях изоляции у двухполюсных указателей оба корпуса обертываются фольгой, а соединительный провод опускается в сосуд с водой при температуре (25 ± 15) °C так, чтобы вода закрывала провод, не доходя до рукояток корпусов на 8–12 мм. Один провод от испытательной установки присоединяют к электродам-наконечникам, второй, заземленный, – к фольге и опускают его в воду.

У однополюсных указателей корпус обертывают фольгой по всей длине до ограничительного упора. Между фольгой и контактом на торцевой (боковой) части корпуса оставляют разрыв не менее 10 мм. Один провод от испытательной установки присоединяют к электроду-наконечнику, другой – к фольге.

НЕ ЗАБЫВАЙТЕ!!!! Перед началом работы с указателем необходимо проверить его исправность путем кратковременного прикосновения к токоведущим частям, заведомо находящимся под напряжением.

Нормы и периодичность электрических испытаний указателей напряжения до 1000 В:

Наименование средства защиты

Напряжение электроустановок, кВ

Испытательное

напряжение, кВ

Продолжи-

тельность

испытания,

мин.

Ток, протекающий через

изделие, мА,

не более

Периодичность

испытаний

Указатели напряжения до 1000 В:

— изоляция корпусов

— Проверка повышенным напряжением:

-однополюсные

-двухполюсные

— Проверка тока через указатель:

-однополюсные

-двухполюсные

— Напряжение индикации

До 0,5

Выше 0,5 до 1

До 1

1,1 Uраб. наиб

1,1 Uраб.наиб

Uраб.наиб

Не выше 0,05

—

0,6

—

1 раз

в 12 мес.

% PDF-1.6 % 1 0 obj > endobj 2 0 obj > endobj 3 0 obj > транслировать application / postscript2010-04-12T10: 12: 24-04: 002010-04-12T10: 12: 24-04: 002010-04-12T10: 12: 24-04: 00Adobe Illustrator CS4

256172JPEG / 9j / 4AAQSkZJRgABAgEASABIAAD / 7QAsUGhvdG9zaMAwd / 7QAsUGhvdG9zaG9 0AAAAAABAASAAAAAEA AQBIAAAAAQAB / + 4ADkFkb2JlAGTAAAAAAf / bAIQABgQEBAUEBgUFBgkGBQYJCwgGBggLDAoKCwoK DBAMDAwMDAwQDA4PEA8ODBMTFBQTExwbGxscHx8fHx8fHx8fHwEHBwcNDA0YEBAYGhURFRofHx8f Hx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8f / 8AAEQgArAEAAwER AAIRAQMRAf / EAaIAAAAHAQEBAQEAAAAAAAAAAAQFAwIGAQAHCAkKCwEAAgIDAQEBAQEAAAAAAAAA AQACAwQFBgcICQoLEAACAQMDAgQCBgcDBAIGAnMBAgMRBAAFIRIxQVEGE2EicYEUMpGhBxWxQiPB UtHhMxZi8CRygvElQzRTkqKyY3PCNUQnk6OzNhdUZHTD0uIIJoMJChgZhJRFRqS0VtNVKBry4 / PE 1OT0ZXWFlaW1xdXl9WZ2hpamtsbW5vY3R1dnd4eXp7fh2 + f3OEhYaHiImKi4yNjo + Ck5SVlpeYmZ qbnJ2en5KjpKWmp6ipqqusra6voRAAICAQIDBQUEBQYECAMDbQEAAhEDBCESMUEFURNhIgZxgZEy obHwFMHR4SNCFVJicvEzJDRDghaSUyWiY7LCB3PSNeJEgxdUkwgJChgZJjZFGidkdFU38qOzwygp 0 + PzhJSktMTU5PRldYWVpbXF1eX1RlZmdoaWprbG1ub2R1dnd4eXp7fh2 + f3OEhYaHiImKi4yNjo + DlJWWl5iZmpucnZ6fkqOkpaanqKmqq6ytrq + v / aAAwDAQACEQMRAD8Aink / yhpnmhtcu9TuriGS wk9aWZCr81k9RiSGUtyHpk1rvXI9udr5tHLHHHGMvEsb3zFfrR2focecTMiRw / t / U3aeX / yqup0t 01 + 8ikkIWMyw8VLE0FTwoPppleXXdq448RwwIHdL9rKGm0UjQyS + X7ENe / l8NN882Xl28uGltb7i 0VzEAjlH5KDQ8wCrLuMtwdveNoZ6mEalC7B33FHy6Frn2bwamOKRuMuqO1byt + WmlajPp95rN8l1 bkLKqwhgCQD1Ce + Y2l7T7Tz4xkhix8MuXq / a3ZtHo8cjGU5WPL9iVX + k + R3m0230W / ubuS5u1huv VX02SN6AFAUA6k + OZ + DVa4DJLPCEBGFxrezvz3cfJg0xMRjkZXKj7vknmv8Akr8u9Bv / AKjqWsX0 dzwEnFYlccWrTcJ7Zq9B2z2jqsfiY8WMxuvqr9Ll6jQaTDLhnOV + 79iSarp / 5dQ6XPLpmpXd3fq0 fpwyp6QKFwJOJ4Urx / 2jmz0uftGWUDLjhDHvuDe9bdXEzYtIIEwlKUtvL39E / wDMXkHyB5euIoNU 1e9jknQyRhY1eqg0 / ZXNT2f27r9ZEyxYsZANc6 / S5up7N0uAgTnIX + O5Bzfl1oWqaVcXvlDV21Ka zHKezljKSEUJ + Gqoa7bfDv45kQ9oM + DLGGsxeGJ8pA2Pjz + / buapdmYskDLBPiMehe2f84rySP8A l3fK7Flj1WZYwTUKv1eBqDwHJic2 + u + v4OHpT6finmt + evzG0nUb54vK66vpkkzxaLBbi8iueNsy xzNcusFzEPVZi8NQisin4ieNcJyUNH + Zv5jCbUEk8hzsYlaWxUS3Cq6RxoWVpPqrgl2Exj2DmiqY 15BiqqXH5jee59L0m / t / K9zphu3vPrtnc2d3fTxxW6r6J4W4h9MyM9aSbkKQgfbFUkv / AM0 / zbTy 4l9aeUpjqn1y1tWs302 + YlDatJdTFVdeCfWOKRsGYBetT0VZd5V / MLzFrmu2thceUb / TbCez + sy6 ndLLEkcw + FoGjmhiNeakDepFG40OyrOcVfGflrylYeb9f8xS6rd3EU1tNJO80ZVi3OR + XIMpNfhy vt7tjLoY4 / DjGXGa3vyYaHRQ1Ep8RI4VG30P8o5pVj / xDexctg8kFFqfE + mafTleTXdsRF + BjPul + 1lHBoia8SXy / Yo6z + XK6P5103Qbi5aey1J4xFcoAkgWR + BqDzFVP3jwyej9ovzGhyaiMeGeMGwd xsL8uf2MM3Zvh544ybjLqmOueTfy00PUpNN1DWr + O6iCl1WEMAHUMNwlOhzE0PbHaeqxDLjxYzA / 0u7bvb8 + i0mKXDKcr937Ej1rTfy + j06FtE1G6vL5ruKOaOZfSpbsr8inwAV5Bd6 / Rmz0Wo7RllIz 44Qx8BIIN + qxV791 / rcXNi0wiPDkZS4hz7t / JkfmTyB + Xfl27jtNU1i + imlj9VAkSuOPIr1VPFc0 3Zvb3aOsgZ4sWMxBr6iN / m5mp7P0uEgTnIE / juSDVdN / LWLR7yXS9Uu7rU0WM2sE0fpo1ZVD78Ny EJ75t9LqO05ZoDLjhHEb4iDZ + k1176cTLi0ogTCUjLpfv93cn2u / l / 8Al9oKWh2XV76Fr2P1YlWN ZNhStSqf5WanQ9vdoasz8LFjPAaO5H6XLz9n6bDXHKQ4vx3IZfy38ta3p9xP5Q1tr + 8tU5yWNxGY 3YU6LUIa9gaEV75cfaLU6bJGOsw + HCRoSibH6f1 + TD + TcWWJOCfFIdC9T / 5xPluP0J5gt5Gb04rq ErE1aKzIwbY9CeIr8s32uqwQ4el5EebLfOl / + c1p59s5 / LGmNqHlKG3i + u2vqWCCaUyP6vAzPFOr CNk4nmFqOh74DlJ / 5O1D8yLlrkeadKsbONbp47Z7eZg7WyoeMvpg3KsWfjsXSgJ22 + JVifmgfnqJ pl0QyGBfrTRyJ + jCxBvrn6sqiYfaFuLbqKcC9eUtKKoe7m / 5yCj136xHbmXSYHhna0gfTR66sEml tQZR6irHWWD1OXJiI2Hh52xVETL + eyaoIopHktGm9H60U030h8EKfWDFyE31f1HldUDGWigmlfTw qzHyJH5xS31U + aJZZJG1CY6YJvqgZbKimIf6IAux5CrHk1ORC14gK + bfyieJLfzc8yerEqRtJFWn JQLgla9qjNR7XxJyaYRNHilR7t4OX2GQBlvy / wB8r + Q7j8vNc1J4bbQYrHU4F9WzSeZ5kkK77ctq qaHp0zH7ch3jpcYlLMZ4pbSqIiR / b72zs6elzTqOMRmNxZtI49Y1zU / zY09tZiFvd21yluLZa8Y1 UkgAnrXly5d6 + GbWWkwYOyZjCeKEoGV99 / iqcQZ8mTWx8QUQapkPmzzD9W8w3sH + CbfUuDgfXnt + bS / CDUt6TV8Ouafsvs / j08Jfm5Y7H0iVV / snN1mp4csh5An51z + xgTW + oSecI9UmsJrO2u9UWSMT IyAerP6ipuBUgeGdXGeOOjOITjOUMVGjfKNW6bgmdQJmJiJZOvmbeleftc + pa6If8JQa1 + 5Rvrsk HqNuT8HL036fPOL7C0Xi6fi / Myw + o + kSr4 / UHf8AaOfgyV4Iybc6v9BeYebE1DUNTudXGkS6bZmO BTEYmSKLhFHDxU8VFOS / CPDO37LOPDijh8UZJ3Le7JuRl93N53Wic5nJwGEdumw2AZl + eFpdz6zp rQwySqLdgSilgDzPgM5z2KyxjgnZA9f6Hbdv45SnGgTs3 + Tuk6jpd1qWt6lC9npiWhUzTqUDfErl lBFSFVDvg9rtVjzwx4MZE8pnyG / Qj7bXsTDPGZZJjhhw9Xrf / OL8iS + RtWlQcUk1q4ZV8Abe3IGd FqomJiD0iHW4CDZH84pzrf5Qz3uo32p6Z5gudh2HVpnl1W8tWukklVWX6oq + ldQqv1eJDH8QZWDE 8QaEYreho / yc12KbUGj87amiairGXjJdLIJvTSOJxIt0DSMQRjf42HIM5DfCqmJ / LLWJfKlnpF95 jfVNStLm5uf0pqNv9YDfWrS4tDH6PrIeKrdFgPUI2p9nYKpFN + Qb / of6nY69 + jL1Lq2mgvrS1ZCk FpbC3WHe4aRmLKsvqmTkGVeNOK8VVmn / AJHebtNt71LD8wb + 3nu3M31oQuXMzsvqPKpuPTlZ1G7F Q9aEMBVWVesafamzsLa0M0lybeJIjcTNzlkKKF5yMerNSpPjir5W / KRkXXPNrOvNACWTpUCSSozS + 2oJjgA2PH + pyexPqyfjvW + RLv8ALLXtY + pL5djsL0L6loJpnnSRl3K0YgVA3oQa75T25i7U0mHj 8c5IcpVERI82Wgnpc0 + Hw + GXSzaU6hrOv6j + bOlR61CltPZXkEEdvHXgE9QMGBO7c + Va5n6fR6fD 2RkOAmUZ45Ss874a + FcqcfJmyT1kRMUYyAZR558wfU / Mlzb / AOC7fWOKxn9ISW / qM9YwacvSf7PT rmj7D7P8TSxl + bnh5 + gTqtz04hz5ufrs / DlI8ET86 / Y8x1631G51qbV30ybT7Oa4TikkbRohb7Ma 1Cj9k0pnc6GeOGEYRkjknGJ62TXV0WojOWQz4TGJI6PXPzh2r6hq1tF / hSHXuUAb61LB6pT42Hpg + nJ4V698879nNF42GR / Mywer6RKr2G / 1B6LtHNwTA8IZNudX + gvKfNy6jql6 + px6HLpVpDBGskKw tHDEF + h5fhVQCWGegdlHHgxjEcwyzMjvxXI9e8vP6wTyS4xAwiB3bBl / 50Wl1OPL5ghklC2rciil qfY60Gc77G5Yx8fiIHr / AFux7bhKXBQvb9Sn + S2iatZ61daxeQyWemQ2siSTzAxoxLK1PipUKFLE 9BkvbPW4cmCOCBE8spigNyOf33Xmx7FwTjkM5Dhjw9Xpv / OMdxFcr5vuYf7qa / SSOu3wv6hG3yOd BlxmGPHE8xED7A4eOQlKRHIyLNfOP5Z3uv8Amqx8w2Wv3GjT2aW8TLbI3KSKGSaR0LCVF / eeuBuh 6GtQ1BjtyReV / wAlfMmg3WniLzxe / omykZ5dKgjmhinRpfV4NyuZVj + 0wJjVa9etaqp / rn5Zz6t5 hj1WfWGkhFqLOaGaBDI8LTyyTRerEYVEUsU3osojrQBixYDFUF5b / J6DS9RtL68vLe6lgZ3n + r2f 1US1uHukQ / vpm4rMIHoSd4geruWKpLp / 5AT6fqNrf23mBUuLW2ito5lsgJQbeJYoZg5mYCSMLxX4 f7v4P5izas48i + Q7TykmpJbTCWO + uWlijWP0xFCGYxRGrSGRo1bh6hIqoUUAXArwOz / KP88NBl1C 10iytXtbuRvVmElowmXcD ++ IfjQnYjucu1ml0mplGWWzKHLeQr5NWDLmwgiFVL3JPpv5EfnLp2oQ 39ppUcdzbtziY3NoQG + RkpmZqMmDNjOOe8ZCjzcfFjyY5iUeYTS5 / Kz8 + bnWrfWptMtm1K1FIp / U sR2IBYBqMVrsT0zCx6LRwwSwR4vDlzFy / A83JnmzyyDIa4x5BNP8J / 8AOSv / ACzQf8jLD / mrMD / Q / wBmfzT85frcj + UdX3j5BA6r + XH / ADkDqv1X6 / p8Exs51ubc + rZDjIlabBwCPYjMrS9m6HBxeGCO OPCd5cmrNqtTkrio8JsI7 / Cf / OSv / LNB / wAjLD / mrMX / AEP9mfzT85frbf5R1fePkEJqv5e / 85Ca tZNZahp9vcWzMjlDLYgco2DD7LivTocyNL2VoNPPjxgxlv1l1a82r1OSPDKiPgi / 8J / 85K / 8s0H / ACMsP + asx / 8AQ / 2Z / NPzl + ts / lHV94 + QSvXPyw / 5yD1yH6vqNuJLetTAlzZxIf8AWEbry / 2WZ2i0 Gh00uLHGpd + 5P23XwcfUZ9TmFSlt3cnsX5EeR9d8neTJ9P1tEivbm + ku / RjcScEaKKMBmWq1 / dE7 E9ct1WUTlY7mODGYxovRsxm52KuxV2KuxV2KvmFPyl / OvQNX1b9AWttLa3szk3PO0Pqx8mK7Tnmu zbrlut0mk1Yj41ng5byFfJqw5M2Engr1JBafkP8AnHZ6hFqFtpMUdzBKJoiLm04q6tyFF9SlAe2Z 2XJhyYzjlvGQo8 + TjwxZIyEhVg2m9 / 8Alh + fl / qtnq11ptu + oWJBt5xJYqRQ1XlRhy4ncV6Zr9P2 fosOGWGHEMc + YuX4HwcjJmzzmJmuKPLkmv8Ahj / nJj / lng / 4PT / + as1 / + hvsr + Yf9NP9bkfyhq + 8 fIIDWfy8 / wCchNZtY7XUrCCeGKZLhFMtktHjrT7Lio + LcHMvR9k6DTTM8QMZGJjzlyLVm1OoyCpU d7R / + GP + cmP + WeD / AIPT / wDmrMT / AEN9lfzD / pp / rbf5Q1fePkELqnkT / nInVdPn0 + / soJrW4AEi erYr9lg43Vweq5kaXsXs7T5BkxgxnHlvLurqwy6vU5ImMiCCiV8rf85LKoVbaBVUUVQ + ngAD6coP s52WTZif9NP9bP8AP6vvHyCW63 + XH / OROt2xtdQgDWzfahjuLOJW / wBb03Xl8jmbouy + z9LLjxwq XebJ + F3XwaM + o1OUVKW3yeofkB + XfmLybouprrsaQXV / OjJbo6yFUiQirMhK / EWOwOZWrzRmRTDB jMRu9UzEb3Yq7FXYq7FXYq + QvL + hf4ifWb6 / 1W7ge0ndpZAxYFTyYsamtRxOcjr9dLDKIjES4vvf Us2UYhCMYxNhfDoXk + 4mSCDzbOZpSFjDcgCx6Cp4j8cqlrNVEWcIoKcuUCzjCAbyrqVr5xt / L17q ExjuV5xXMTMCVKsQeLE03QgjLx2hGWmOaMfp6Ft / MQlhOSMRsmd95b8p2F3JaXfmm5iuIiBJGQxI JFewPY5jYtdqZxEo4gQWiGfJIWMYpLNQsNAWXT4NL124vnurpIZyGKsiPQVCkDucysWozkSM4CPD Gw3Y5TqRlACh4JvqnlPy1pdyLbUPM9zbzlQ4RuRPE1AOwPhmHh7R1GWPFDECGjHqMkxcccSEq1Ox 8swWfLT / ADDcXt00sSCLkyEIzUcioFTTMvDn1EpevGIxot + OWQn1QAFFONW8m + XtIkjj1HzLdW7y gtGGqagGn7Ncw8HaefKCYYgacfHqpz + nHEoC78nfWtMm1Dy3rr6mLYEz25ZhJQCvw0Na + AI3y / h3 mYzEM0OC + RbYaoRkI5ICNvZv + caby7uvIN39Zmeb0dSmji5ktxT0YX4ivbk5P051OmFR + LyPtTjj HUihVwh4yZJf / m55T0zUNUtdUS + soNLdY31BrOeW2mNVWQwvbrMxWKSVI5GZVAZgN65kPNKMX52f l25vq31wi6exWZjZXZ5cUiZ + CpEzVj + sKroQHUg1UKK4qv1H85fIdp5fh22C8fUbGeWeKL6ohMjG 2QyTNxl9L4EUD4uh5LSvIYqlzfnx5TTQf07NZahDp / rxwF5FtlaklvJcGYL6 / wAUarCy1WpZtkD4 qyDyv + ZPlLzTei10G4lvf3Mszz / V54Yk9F0jaNmmSP8AeVl + yAaU + Km1VWUYq + StD0F / Nev + YXvt Vu4ZrW5eRpFbkGV5H61NduOcj2pr5afhIiJcXe + nZcowYsfDGNGI + 5qPQfIs0ixR + cZ / Uc8U5BgK npUkKPxyg63WAWcI + aTmzDc4ggNR8n6npnm + w0O71GaS21BlEN1EzK3FiV3Uk0IPUVy / D2nHLp5Z Yx9UOjdDVQnhlMRFx6JxqflHyjpd41nf + a7qC5QAtGwYkBhUdAR0zEw9panLHihiBj73Hx6nLMXH HEhKNW03yxDBajSfMNxqFzPeQwSpyKFYXD82CkCpqF37fTmXg1OoJPiYxCIiT8dm / FPISePGIgRJ + Kdav5L8raPcrbal5purad0EqowYkoSVB + EHupzC0 / ampzR4oYgRy5uPi1eXILjjiQk2r2Hk + 10q 5uLDzLcX17GI / Rt6tHWsqK5FRuQhbbMzBqNVLIBPEIx3359D + lyMUsspgSxiI / YnWqeSPLWkrbnU vM93am5XnCHBJIFK / Zr0rmHh7V1GW + DFGXC42PV5J3w44mkFN5Fj1DT5rvyr5hfU5bYVltGLK57 / AA7ggmm1V38cuj2tLHMRz4 + AHq2x1nBIDLj4b6vVP + cZLu8n8p6olxNJKIr4iNZGLcaxISBXpvnV aXkXmPauERmjQq4 / pKdefvP / AJ98veZoLbRPK0 / mHSHgT1RBBOricmQv / pSiWNVVfSAUxblmq68c y3lkfp3nLzjqHlLVdWHl2az1FIruXSrOWKU0a3t0aGOeKX6pcyPNMXUelHSgpy6MyqEPnH8xJTr8 dvoqq + m / pCSweW0ugsy2iyJbxKOYMzzy + k6slFKc1G4DFVLtI8 + / mle + Z20ubQltrOa44Wt1NYX0 cawklnaSdn9MtCkbD9kStTjxBXkVQtx + ZX5sW9xZ18sPLBw0975Y9PvS7PPBDJcRRN6nBW5yyKGa qxenxfkzgAKzbyNrHm7UX1aPzHaxW72Vz9XtXt7e4gjlVAVd1a5blIrMvJWVePEijMa0VfP35dtC lh5oadDJArsZYwaFkCyclqOlRnCdsgnJirY / tD6ZrrvHXc35Ni / L3WLx / qOk / V9QtQJYIp5pGD07 iruNjSu2R7Qlq8MfVO4S2NAfqZas6jGPVK4nuCV2Os6lqv5o2UmoQC1nt3e3FuN + CokhpyP2t2Jr mVk08MWhkIHiB3v5N08UYaY8JsHf7ky80eY9GtfMF3b3HlWO / kRlD3hIq9UBrT0m6dOuY2i0mSWG JGYxHd3fa06fBM4wRk4fL8FhkSyT + bYtQjtpILO41NWh5oVCiSbmqbfCDx7A5uDUdOYEgyGP7g7A kDFw3ZEP0M / 8867pdjrSw3XlyPVZPRRvrTmhAJb4P7t + lPHND2bpsk8VxymAvl + CHV6PDKULE + Hf l + C8 / wBXkF / r51Cz0 + Szsa249HhRYuKJGRUClOY2PfN / gHh5uCUhKXq + PM / c7TF6cfCZXLf9LK / z jgmk1LTjHGzgQvXiCf2vbNV7PyAhKz1cLsqQEZW3 + UlleWc2o6jdI1vYLCFaWQFFJVuRIr14gGuP buSMxGEd52vak4y4YjeVvWf + canjk8laq8YpG + sXDIPAGCAjOu0YIhReT9qRWojf + pj75N + Z9T8x W2pXMk / kGx8waalzcf4fhW2nFyhWRVvJZn + rXUSNcu5kjNEDqp + JmK1ynmkHH5g1v61qLS / lTbtM kMgs2ETL6lusQ9SJ5fqbgiQtccFoGYUVo151YqjZrlb3yXpeon8voNP9O4vYV0a60w30lvA1pcOs kdvAkbp688caOOPxciK7h8CpA975jsPLZdfy402 + tkvLaCfSbTRp4AzSWqzXEyRyqWMayx + j6vpb Eg8X4DmVVvLXnrzDo41G + X8ppbK4qBw0uya3uGtwyrFGzCHjP6ZPxFXG26x8QxAV7Vp89zPYW091 b / VbmWJHntSwf0pGUFo + YADcTtWm + KvmX8sSg1 / zYXHJA55L4j1JajOD9ofpx13n9D6T2h / dYvd + gKfkuL8sdd1Jre30U215EvqwR3E0siycftbF2U8fAjIdoy12CFnJxROxoAV9jLWHU4o2ZWPID9SW Xmu6vqn5o6XHqdstnJZXUcCWynkFHOvLmQOXKta06Zk49NjxaGZgeISiTfwbo4YQ0sjE3xDmnnnj zJo1j5int7nyrFqsypGWvHahaqAgf3T / AGenXMHs3R5J4RKOYwG + 34IcbRaecsYIycPl + CwC9f65 5qXUreyltbCa8hEaunFUJIolR8NfhNM3 + McGDgMhKQiev2u1gOHDwkgy4S9J / MPX9K07WoILvy1H rMjWyuLpzQqpkcen / dydKV6985vsnS5MmImOU4xxcvgN + YdPoMEpwJGTg35fLzeaeabhdWvvr2n6 VJYWkNvGssCp8ERXYnkoA41PUgZ0uih5UOGcxKRJ3vm7nSjw48MpCRJZh + ckE8v6C9ONnpBJXiCa fY8M1Hs / IDxLP8Q / S6 / smQHHff8ArUvya0zUoNZvNRmje309LZo5JZAVRmLqwFWp9kKST2 + nJe0O aEscYA3Pi / Wy7WyxMBEbyt6r / wA46TQz6V5kng / uZdWkeLt8LIpXb5Z1PZ0THGAeYAeW9pwRkxg8 / DZF5x8tfmRe + arHVPLGuR6dYQpbxXdnOzvG6rJM07eh6boWZXjUHkCd91opzYPMJF5X8o / nxpt1 p9vf + aLOfR4ZG + viRjd3LxmXl + 6lltY3DcGI / eO9KCm2wVT / AFzyx5 + vvMMdzBrEcOmNai2nW3lu LUgPPL6pSAGZBJ9XdAkxcsJFqFVajFUF5b8kee4NRtLnWNXcRBna8gg1K9uVKfWHuERfWSJf2IFL cR8Pqr9llVSqS6f + Xv5w2eo2t2fMiTCC2ijdZb ++ lja4giVFlaBkCMrbrIpPxf3hq5 + FVnHkXy35 g0RNSTV9Tl1FZrlvqBmuJrl1tlZvSZ2lC8ZChVXVBxqtaksTgV4Zbfll + c + jyaja6do0E9peSuZJ TPakSIagU5yowWh7gHNFn7KGUxlIG48t30I9r6DIImUyCB3S / UlGmfkz + cWmajFqFpoYS4hYslbq z47gilPX6b5kZtEckDCQ2Lk5O3dDOPCZ7f1Zf8Smc / 5c / nfNrUOtPoEA1CAELKs1mK1HEFgJ9yB0 zGj2QBiOLfgPm0Dtbs8QMPEPCfKX / Epn / h4 / AJyG / wCrNB / yNsv + q + Y3 + hzF3H5tP5 / s3 + eflL / i UFqfkX89tTFr9b0KFzZzrcwkT2Y + NAaVpPQjfLsPYkMd8IPqFHdtx9qdnQush4Fcpf8AEo3 / AA7 / AM5Df9WaD / kbZf8AVfKf9DmLuPzavz / Zv88 / KX / EoXUvJX586laG0u9DgeEsj0E9mDWNw46T + K5Z h7ChjlxRBv397Ph3l2dA2Mh + Uv8AiUV / h4 / nIb / qzQf8jbL / AKr5X / ocxdx + bD8 / 2b / PPyl / xKXa 15A / P3WLc211pnG2b7cUVzZRhv8AWpNUj2rmRp + xceE8UY7 + ZbsPavZ2M2J7 / wBWX / EvW / yN8m65 5T8nTWOtRLBe3N7JdegrrIURo44wGZCy1 / dV2ObnBExG7y / b + ux6nOJYzcRED7Sf0vQsudG7FXYq 7FXYq7FXzXH + W / 5y6FrGrnRdJguLe9uHb6yZrUiSPkxWgklRwKN0K5otV2SM9cYPp5bvfjtbQ5cc OOZBiOVS / QCkNh + TP5wWGpxaja6Esc8EnqxD61acQa1Ap6 / T2zIy6I5IGEhsRTmT7d0M48JybH + j L / iU1vvy9 / PC91i11efy / bm / syDFKs1ktafZ50n + Lj2zFxdjRhjOMXwS83Hh3r2fGBgMh5T5S / 4l Nv0N / wA5F / 8AVng / 5G2X / VfMT / Qzh7j82j852Z / PPyl / xKA1jyX + fWsQW8N9ocDpbXEd1Fxns1PO IMADSfdTz3y / T9hQwkmAO8THn3tuLtLs7GSY5DuK5S / 4lH / ob / nIv / qzwf8AI2y / 6r5R / oZw9x + b V + c7M / nn5S / 4lDal5V / P / UrCaxvNCt5bacBXX1rMdGDdpx / Llmh3ex45icQQR5s8ev7NhISGQ2PK X / EohdE / 5yJVQq6NbhQKACWy6D / nvlZ9msPcf9Mw / Odmfzz8pf8AEpfrfkr / AJyD1i1a0utNEds4 pLFDcWUYceDETciPatMyNN2Fiwy4ox9XmbbsPaXZuM2J7 + Yl / wAS9N / IfyT5h8qeW762123W1urq 7MqQCRJSEEaqCWjLruQe + brBAxu3nPaHX4tTlicZsCNd3Xzel5kOgdirsVdirsVdir5S / L7y15g / ME + YL + 687X + lTaVKJLsuJJYzFLzYOHFxDxp6T1XjQClD2G2yzGOhwg24MImZPqIR8PkTTLyZLXTf ziS4vZmCwQO0kQdj0UN9abc9hTfInKRzx / j5JEL / AI / x82OzeU / Pun / mPY + Sdb8xXtpJfsog1CCW adGSUMI5FRpISVLrxapFN + tN7fEgYGQDDhmJ8JLKdT / LzS9LvprDUPzhe1vbc8ZoJElDqSAaEfW / A5VHMSLGP8fJmcdc5 / j5sc8waPFYXejW2kfmRca5 + k7xbS5e2aQNbq5UBzH9Zbn9rb4l6dcshK7u FUxlGqqV7sp1v8sLXQr36jrH5uSWN5wEnoTJKrcWrQ0 + t96ZVHOZCxD8fJmcdc5 / j5sb8zaLpuka LLqGn / mjNrU8UkStZ2zOkvCSQK7qDctz4rvx2 + YyyEiTRhX49zCQoXxWyjXvyoTy / PFb61 + bM2nz TL6kUc8cqllBpUD630rlUM / Fyh + PkzliI5z / AB80j8wflv5yg0G417yr53bzTptmvO7 + q3MqTIoX kx9NZZh8IG45cvbLIZo3Uo8JYyxyqxK3qH / OM + sarqnkC6k1K7mvJLfUpoIZJ3aRljEEDhAzEmgZ 2OYmtiBPbubtNImO7NJfzK8hQapqGl3eu2lne6W8cV6l3ILZFeVeaKsk3COQ8eoRjTvTMRyF0f5j / l + / 1qnmPTVWz4G5d7qFFVZFjZH5MwVkYToA4PGppWu2Kql75 + 8oWYsy + pRzi / eeO0Nor3YdrVeU 4rbLLT0x9qvTp1xVL7r82 / y + tdPGoz6rxsy9vEZBb3LlXvIDcwq6rEWQtCpc8gOP7VKjFU + tPMnl 28u0srTVLS4vJIhcR2sU8bytCyhhIIwxbgVYHlSm + Kpjir5V8maH5k / MbzD5kkufON9pU1hK0zkC SWIxM7jak8PAJwoF40pm2ySjjiPTbgxjKZO5CLj8kaPcSLBZ / nIkt1IQsUbmSNWY9uZujT7sHikc 8f4 + SeD + n + PmkGreT / zB0T8wNL8oax5iuov0tJEltqNvPNMhSZ / TD8Gkib4X2ZSR7V2rOOSEoGQH JgYTEgCebKtY / Law0a / k0 / Vfzeks72IKZLeVJVdQ6hlqPrfcGuVRzGQsQ / HybDjrnP8AHzYz5s0m 00bTLa60r8zJtemmvYbWa3tmdHihlSRmm4m5cvxMYHYb7nfLcciTvCtmEhXKV7ss178qovL9zHa6 1 + bUthcSp6scU8cqsyEleQh2vpVTlMM / Fyh + PkzliI5z / HzY15l0LTdK8v32pab + akmtXtqsbRad C0kTyc5442IJuXrxVy1AO3hlsJkkAwphIUL47ZHq35WR6PFaSav + a8 + n / Xo / WtkuI5UZkoDWn1vt yyuOe + UL / HuZnERzn + Pmleq / ll5vk0a41fyf56Pmq3s1L3UNtcyRzqoUtsgmmHKin4SwJ7A5KOeN 1KPCg4pVcZWzj / nF7X9a1TQNZg1G9mvEtLiL6sZ3aRkEqMWAZiTQla0yjXQAIps00iY7si86fnfo 3lHz7Z + WNStl + pz28Vxdan64U2 / rSPGOcTJxKrwUs3q1o2ynvguSn / k78yNE81tcrYWt9A1rdPZS G4t24erGhdv3kRljUDiRV2Xeg7rVVifmf89W0OeWA6LHNLF9aLc7wxKFtr65sw5PoPRX + pH / AJ6O kY5VLBVQuv8AnIS1tteGny6OIrKOSFru + muWj9K1uAkscxT0GBc20wm9LnyAWTlx4VZVETfnpLDq g02TQlFy0xtkgF8hla4EcJ + qgGIIbgSXSIyB6A1 + LkOGFWYeRPOM / mi31WaSzitBpuoTaehhuDcr KIQrCXl6UIXkHHwblejUYEAK8U / 5xxNmNM / MM3qu1mIIDcrHTmYuF3zCVIHLjWmbLWXcK / HJw9Pz kq / ln5R / IvzXqUz6Ja6o2o6WFuk07UZo4 / WCnYr6TOCofiGqw6jtjmyZYDeqKcUccjt0SF / PGpeb vz90C6vrA6W9hdw2KWDktJH6UjFhISF + PmzV226e + WeEIYTRthxmWUJn + ZXmf8oLTz7q9vrXk2fU NSjnUXd8l9PGJG4KeQiV1UbdshhhkMBUqHuTlljEjY3eX20 + n3f5kx3ulQGDSZ9aWSyi4BBHDJdc ok4iqrRNqZlkEQo86aB9djlb2f8AO7zD + WFh52MHmTypLrOpfVYWN4l7Nbj0yW4pwjZV28cwdNDI YemVD3OTnlAS9Qt4d50vvL + peY7q88t2LafopitxBZkbxcII45ORq1ayhviJ + KtTucz8YIjUju4m Qgnbk9U / 5yv / AOUr0X / mAb / k82Ymg + k + 9ydXzDv + cV472LX9dvpKx6LHYcbuZzxgEokVk5EkLVYx IfYeGOuqgOto0gNnuZ9 / zjE0DeSdYa3FIG1u5MQ8EMFvx / DMfW / UPc3abkfez3Vvy + 8o6sgTULJp kDzyMgnuEVzdSrNKJAkiiRTJGrBXqFKjjSgzDchCD8qPy / Es0o0kB7hZVnpNcUczqVldl9Tj6jjq 9OWy7 / CtFXRflT5Dh0y00u301rexsjMbeGC5uoqG44 + ozMkqs7fu14liStBxpiqEl / JP8spdMXS3 0djp6XC3iW / 1u8CiZU9NWFJtgEJHHp7YqmGgfll5I0DUoNT0vTTFf20BtYLmWe4uHWIsW4gzySfz kV60 + HptirKMVfN3 / OO5gGv + ejcBjAIT6oT7RT1JeVK96Zs9Xyi4mn + qSz8uvKX5A + cdWkstNg1V L22UTpZajNHGLhVPxKhhZyaftDkDQ7d6ObJmgLNIxxxyOwSzXPO + o + afz48ufXdOOlHStRtrJbN2 5yApcAuzsAASWO1NqePXJRxCGE0bsIM + LIPJPPzg8yflTZfmBqFt5g8oTarqiLB698l9PAHBgQpS NHVRxWgyGnhkMBwyoe5lmlAS3G7xfXbnSr3zVc3mi2xtdIkuVa0t + NPSjJHFDSu + 3jvmbEERo83G NGVjk + gPz6178uNO8z2EXmjyxLrd69krw3Md3NbBIvVkATjGyg / ECa ++ a / SxmYnhNOXnlAEcQt4J 50v / AC1qWtfWfLGnNpulLbxAWbVdo2VaSFnJYvVv2id8z8YkB6jZcPIQT6eT03 / nJn / pj / 8AtnN / zLzG0X8Xvb9X0UP + cW7fU / 8AG1 / eRBl0yKwkS9lO0fJpEMaknbl8JI9gcdcRwgdbRpQbPczz / nGy S2kn86SWpU2r6kGgK7L6ZMpWntTKNb / D7m / T9fe9szBch3KuIBFDuD1GKuIBFDuD1GKuIB674q7F Xyt5Y0785PJcWu6Xp3k8Xceru0V9PNFPKXjUOirG8M0acaSMQQK79embaZxTomXJwojJG6HNjvlf yT + bvlrzBaa5pvlq8F3ZuXjR4pPTYEFSj8GRipBoRy3yyeTHIUS1wxzibAT7ULb84L7zxaec38jJ Fq9qwkZYra5WGaRF4o8q + uWLLt9lhWm9crBxiHDxbMyMhlxVuyiXz1 + fc0jSTfl9YSSN9p30 + 4Zj 8yZ8qGLF / OPzZ8eXuCSeZbv85 / MKaaLryLHbNpd7HfwC0tZokd4wfhlX1WLA7fZYZZAYo36ubGXi Honk / n38 / rh / UuPIFjNJSnOSwuGNB2qbg5WMWEfxH5suPL3BJ / M + o / nP5k0SbR7 / AMgwwW0zxSM1 naTwMTDIh5ufVYlWpQ0offJwGKJsSRI5JCjFNL7zr + e2oOr3 / wCXen3boOKNPp08hA60Bec0yAx4 hymfmnjy / wA0JP5r1X / nIPzFpDaO3lqTStLkUrPa6baPCsqnqHLvI1D3CkA98njjhibuz5sZnLIV T0 // AJx18r695d8jXVrrVm9jc3Goy3EcEtA / pmGGMEr2q0bdcxdZMSnt3N2ngYx3eo5it7sVdirs VdirsVfLWgaX + cPkbWfMEeleUhqC6lK8U1zLFPKjwh4p6TQywjiwetaV + WbWcscwLlVOEBOJNDmx XQvIX5s6Hr9preneWbyK6sp1ngj9KT0 / hNeDUYOUI + EjluMtllxyFEtUccwbAZJrkX5x6x5w07zb ceR0h2jTnjkDwW1yiTNCax + upmYtwpsQQabHYDK4 + EImPFsWwjIZXW7J5 / Pn5 + TyGWf8v7GWQ9Xe wuGY026m4yoYsP8AOPzZ8eXuCR + bLv8AObzPo8emX3kSO2iiu4bwNZWs0PJoQ4CSVkcsp9TsQRk8 YxRNiSJHIRRCe3Hn / wD5yAuWD3HkGymcCgaSwuXIHhU3ByAxYR / Efmnjy9yVeYdZ / OrXtAv9Fu / I UFtBfokbzWVnNDKOEqSj4jLJUEx7imShHFEg8SCchFGKOuPOH553McEd1 + Xen3KWyCOAT6fcSlFA AoC9wx7YBjxD + M / NPHl / mhLfMeuf85Ca1oz6NF5YbR9OmUxzw6ZZvD6iMKFSXeQgEbHjSo2yUI4Y m7s + aJHKRVM7 / wCcbfJ3mPy5oertrdlJYSXlxH6EMw4yFYkILFewJegzh2mSMiKbNPAxG72HMNyH Yq7FXYq7FXYq + T / I19 + dn5h4Gv3Wmeehpo0q4P1q3uC8SJHKXKMpjjZAn7txSu1MVTu08rfnXfSe hp / 5taVeXLbRwxXxdmY9BRI2O / yxVh7ap / zkFa / mJaeRNV803GnapesBb3EkhkgZXVjG6tGjEq5X j02PWlDirMLzyz + c1lcyWt7 + bulW11EaSwTXxjkUkVoytGCNjiqReZJ / zd0Q6MifmbDqj6zfpp8b 6fN68UTPSjSuq1G7dAuFWQ6j5R / O3TLj6tqX5s6bZXHEP6NxeGJ + J6NxeNTQ0wKkvmQfmvoPl271 uT81bbUIrR4EeLTp / rLKJ5liLycVBVUDV2BJ6YVT3UvJf556XIkWp / mrp9jLKOUaXN20LMK0qoeN Sd8CpL5v0X / nI / y / oMmv2nnH9PaTArPdT6bceoYkT7TsrInJV7lCab1AGKvTv + cZvN / mPzT + X93e a / evf3dtqc1rHcSAc / SEMMoDEAVo0rbnFXpsOu6JPqs + jw6hbS6taoJLnTkmja5iRgpDSQg81Uh2 3I7jxxVFCeBp3t1kUzxqskkQYc1RywRivUBijAHvQ + GKr8VdirsVdir5G8p6p + d35keZfMy6N53 / AESNLuXd7WZ5IokheRwnp + nG6hU4U3NcUpva + V / zrvJRBY / nHpF1cvtHDFqTOzMdgAFjY7n2xVh + paj / AM5E6T + YOn + R9X81XdnqOpyRx2d2Zme2kEzFEkV1XkV5jifhqO4xVmeoeUvzu026ez1H84dK sruOhe3uNQeKRQwqKo8YYVBrirH / ADhP + bvlrQbfVj + akOri41G30309LuTciP6xHNJ6srAArx9H ZQprX23VZJqnkn89dJmSDVfzc03T53XmkV1fyQuyVI5BZI1JFQd8VSPzLH + bmheV9V18 / m1a6oum JC5s9MvDcyt61zFb1YUXgq + ty5b9KU3qFU6vfJn566fFbS6j + ben2C3aCW2F3eyQF0IBqokiUnqK 4qlfmby7 / wA5K6ToE2vab53HmPTrUM122lXbTPGqDkzcWROQUbniSfamKs // AOcU / PfmrzV5c1se YdQk1KWxu4xbzzUMgWWMkoWHUArUfPFS9kbXdDXVl0ZtRthq7p6qaaZoxcmPf4xDXnx2O9MUKd55 l8uWKRve6rZ2qTPLHE01xFGHe3JEyqWYVaIoeYh3aGuKo + SeCJ4kkkVHnYxwqzAF3Cs5VQftHgjN QdgTiq / FXYq7FXzD / wA4vrava / mal27R2jJbi4kQVZYyL3myjfcLiqz8sfyh / JLzHqT6h5d8w6rq lxorR3T2BEdtK5U8k4840YqWWhIIoe4xVKp / zGTz1 / zkj5YvobGSwttOuI7CGG4ULcH0nkZjMoJ4 tzcjjXb78VTf81J / + cd1 / MHWV8z22tProlT689qV9At6SU4VcGnGnbFXjlkdHb834DolP0MfMCHT OIYD6r9dHo0DfFT06dd8UvfPz3n / ACNTzwo87W + rSaz9Tho1gVEXo8n4dWX4q1rih86fmC3lFvNd 03lAOvl70rX6kstRID9Vi9X1K / t + tz5dq9NsUvY / + cyP + Up8vf8AMDL / AMnsUB3 / ADh5JqT + YPMN q3J9EaxVrqNqmh2zIFj5AjjVo / U + YxUvRf8AnFJbVfI + vLaEG1HmC7FuRuDH9XtuH / C4qyHX / wAi PKmu + ZNR1 + / v9Qe51QBbm35Wz24T0hCUSOW3k4 / Aoo1eSkBlIYA4qnXk / wDLHQvKuovqNjPcT3Ul qtk7zrbCsSSGRT + 4hh + KrHk37fV + TfFirLsVdirsVdir5Y / 5xeWBvNH5jrOxSAxkSuu5CGafkR9G KSgfy1 / Jj8hfOeryQaJ5n1W + nsFFxNYyIlrI8daVRmjBoGoGK7io6VriqG8zfmVH54 / 5yM8nmHTp 9Nh0XUbew9G7AW4Mi3VZDIilglG241PTFWQ / nfP / AM4 + p + Y + или 5xt9bk18R2 / wBZexMfoFfQT0 + P J1P2KV264q + ffMjeXG893B8tAjQTdx / o4EEN6Pw8eXLfl4 ++ KX07 / wA5FzfkonmrTR59g1aXUvqI Nq2mlBH6HrSbNyZTy58voxQHzP8AmM / kZ / MCHySsqaF9Vh9NbmvriWh9T1a1 + Ll4bYpevf8AOXf / AEw3 / bNl / wCZWKAhP + cOJtX / AOVhalbwM50t9Ndr + P8A3XyWWMQkjpy + JgPblipel / 8AOKq2i3Hn 9bMKLRdZItgn2BGDJw4 + 3HpipTT81NL8hjzrbfpsa02pXoW7gns1spLSMIiwmN0uldSOEJcq6Nz + IDl9gFCR3WnflU + pW + jXEWv6XCY5b6ef / RILaRNStbeOSe5pV + Q + rxysvAMrtyK8fsqFHTdL / LHT PM1hK9nrp1OzvEkijuLfRw31yO0DRW8qxIkxkuEHAKd2k + MkE + oVL0Rvzh8q6XqC6MLLVJH + sXkP quY5gJra6kjuFMk1wZDxp6ijpwKqvxUQBXo2KuxV8ceSde87 / l7 / AIp0o + R9Rv5dblaG8mKzxhYk EiIIwsMik / vnPOpBqPpVYl5AX8xPJfm208w6f5d1VzbFhJa / V50E0TggxSN6TAqdq / D2qKGhClkm peZPM91 + Z1h5 / g / L6 / tLy2f1ruyjS49K4mVSqSE + hVDuOfXlTsanFDKdQ / NXUNSvJb7UfyTtr29n IM11cWLSyuQAAWd7QsdhTc4qkHmPzZq + qrpH6P8AyrfQTpWpwam66daPCLj0A1I5ClslNyN98VZH q35v6zrN39c1f8mYdSuwojFxd2bzycFqQvOS1ZqCvTFWPeavNV5rnl660e1 / KP8AQZungaS706za GVkhmWRoyyWqGjBSPY9sVZLrP5zeYNcljm1r8nY9UlhUpFJe2slwyKTUqpltWIFfDFUh8z / md + Zt / wCXJ / LvlvyG / lTS7wMt4mnWEyu6OOLqCsUaqGGzELX3xV6z / wA4q6DrWjflxdxatZTWE11qk1xB FcI0TtEYIIw / FgGALRtTFXsmKuxV2KuxV2KuxV8YeUtc8 + fll5k83W / + Cb7U5tWneCWQpcIghDyE GMxxOG5iSoavSmKWC + TrX8wPKfm + x8xaV5e1ZGsZ / VW39CcF4a0aF5BFuHQ8WPH6MUst8xea / M + s fmRpXn2P8vL6x1Swminu4YkuTHdPBT0mesFVYUAYjqB474oZXqv5w6tq969 / q35KWuoX0gAkurqx eeVgo4qGeS1ZjQCg3xVjfnDzbqWv6FHplj + U / wDh9kvre9kn0yyeFpVgDhonKWyfa57HenhirKda / OzzBrtwlzrf5NQapcRJ6cc17ZyXDqlSeKtLbMQKkmmKse8yed73WPLep6NZ / k9FokuoRJF + kNPs WimQLKkhFVtkJDBKdcVT / Ufzp8warDaRax + TsWq / UoxDavf2styyIAAQpltmpXiK0xVKNe / N38zp fL9xoXlP8v8A / CFneqyXb6bp8qyMrgqwQrFGiEhvtceQ7EYq9H / 5xB8s6 / o3lbXJ9WsJ7Bb27j + q rcxtE7iKMhmCuAeNWpXxripezan5N8oarcSXOp6Hp99cyqFlnubWGWRlUFVBd1LGisQN8UOk8m + U JL2S + k0PT3vpWZ5bo2sJldnAV2aTjyJYCjVO4xV0Xk3yjFeLexaHYR3qTvdLcpawrKJ5Kc5eYXlz biOTdTQYqvbyn5We9W + fRrFr5JROl0baEyiUO0gkD8eQfnIzcq1qSe + KprirsVdirsVdirsVdirs VdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsV dirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVfN1uPK dvNqrx + Z9e8vwvNdNemKz1dPrV8VQvqMT2dxJF6LvxkVGXmVruFwqrLc + XYtO1Qp + ZGr6Wn12Ro5 DbakBBcfXJ / UnbjK0bwPIJgfsp9j1fjB5Kqfmi18qu2k6nP5ml1uY6Naqt62n / WLqS2i1OBVJe4u YeMrzzNwHEyBeZJLrGQqlOuLod9onkuXUfMd9oz2T6reNqlzp0bTpc3V7JIZJ1ivpLiKQzQGMLHz bl9rhWgVer / l9eRTa3q6nzpeavNdSWbwq8X1a2MkQma4gsku2n5rJ6LmT0tlWgVqqSArz / znH5b8 y6rea7FLeRcki1sWzafb3PFDpVvNNET9ciWjWsC + tyortxQM3FgxVA + Y9N8vX3mG50xtQvZLpoJ9 KnElhBcpNcxTP9WIJvEYs4shbwIEBZ4kd / hpyUIjzPZaLD5o0 + dL65j1OGT0reY6fbSkX1jeXXq3 szPfRtJJLc2k8oCL8MZKhQ8lSpeiflANDsNX1 / S9NF1Ks8i3kd7cQrGksFeEBWZ555rkmFo29Sip xK / CpJGKvUMCuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KpfretQaTaxzPDLdTXEqW9raW / D1ZZZK0Rf UaOMbAsSzgUGKsV0786fIF / qemaXFdzJe6rHE9tHJbzKOc / D04ufHg7n1N / TLKvFuTCmKusfzq8g 3VlFdvc3FslxI8VqktrcNJMYlQuYliSUsFMyrt + 1t3FVXeZvzm8naDpS6ofrOoWvqNFJ9UjUMnCO OVnK3D2 / JQkyh5OR + LpiqjYfnd5Qv76ewtI7m4vLZLeSeKA2two + tUEQEsE8sLku6p8DkcmAxVEN + cvke30qx1LVJrnSodSRpbRLq1mZyikiregsyoWZWVAxBcj4QdsVVNK / OHyDrBt10a + l1Jrm5jtI xBbXFBJIyirvJGiIqhuRLMK0IFWFMVS / TPz + / LK9sre4l1CawluRK0dld206z8YSwLcY0kUh + BCc WPI / CPjquKss8tebtC8zWrXejTSz26caySW9xbirVoB68cVTQVoOxB6MtVU4xV4r + mfM8N7cNd / l np + oXh2ab9GSw29xbsmlemDFaSyNZ3KeqYyyNEHWp + ER74qubzBqkdrqrXH5Tw3TrJS4jit2U3Np 6 / GIBWs2E0qRrA3DkR1JKFCqlUZ5kluU0PS9Zs / IdlFqdxpjstncaTLqEtrcwXFoLW3ZrVFkSPg0 j04ArwBoCvEhUBcX + u29l5XVvy4stUsNTluba / tIdMa2azt7e6kFszRSiUQhxMJVEgArz + zy + FVV 8s / mB5u060Y / 8qxnh2PULoLeyadbPZJLcTMxWecSRGicftS + o9DXlxqtVU38zteab5jsbbQfJdqF 1KGfTL68l04TBoCnoQepNaMUS1T0ImeOSrNHRVVSpxVA + X31vUNUtr + Tynp1vNPcyPb3cui3FpPF cy3Ll7qR5mDittayOxIUu7Q / EC / FSqTalrfmx9RsLq7 / AC + s7ySNbGS6m / Q07ziS5SO5uo4JWYiN zPdTnkSRGyHnyeTYK9j0XRbOxjW5axsrfVp4II9RuLKFYlkaGMIFBpzMaU4xhiaLQYqmeKuxV2Ku xV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KvP8A88fOOmeVPIr6hqOi2 + vwTXMNsNOuwhgZm5OGcOkgPH09vh64 q8LP / OSKDU7LU1 / Luzj1HTvU + p3MbvG8fqh2cArCNm9Z9j3Ynqcj4ke9zf5N1P8Aqc / 9LL9SnN / z kZaGFRN + XNh9Ughe2W3Z2 + rLFNLHM6 + iYfR + KWCNq8a1UeGImD1asukzYxc4SiPMEOX / AJyP0 + W2 eNfy00uS2maVpECqY3afh6xYfV6EyeknPx4ivQYmYHMri0ebILhCUh5An7lO5 / P7RrqOGO6 / KvSJ 47ZСлуксSOsaM7SFUDW54gu7NQdyT3x8SPe2 / wAman / U5 / 6WX6kZff8AOSaXMK2F5 + XOm3VvbLFH HbuVmjjSJT6KqvoMoCLI3EDpU0648ce9hHRZpSMYwkTHnQJr3qFn / wA5E2NlPBcWf5Y6XbT2rtJb TQosbxO44u0bLbgqWGxI64 + JHvZ / yZqf9Tn / AKWX6l // AEMTaRPAV / LPSleBP9HKBCYkkqKLxg + D lx6bY + JHvYDQ5zIxEJcQ6cJv5IzT / wDnKe + 05SmneQrWzVgqstu7RAhBRQQkI + zXbHxI97P + TdT / AKnP / Sy / UiY / + cyNTjukjvPKsaRhgJ1W6cSBa70DRdadK5IG3DMSDRfT + KHYq7FXYq7FXYq7FXYq 7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq8V / 5y2 / 8AJWQ / 9tO3 / wCTc2KvmGNbt9LtxaypHNxj JaQcqrwNf2X70zAuImbfQdRh2WTSYPy5IPAL3r + EL7cXcUMr6hNE6DjR1Wiqu / IN8Kg127GuCVEj hC6Q58GOf52Q8MjkSCT3 + 9D6ACdNkEVQTLKIyQGIJjXiSOhpk8 / 1j4OB7PxkdJlEZcEr2PKtu9q + Gr2lq9w10GCU + H0IxWpA60yUeAmqaNRDV4sUsn5gS4a2jIk8wP0u8v3MlzJdzzfE7PByAAFaBx0H sMjqIgAAebb7N5J5MmWRPqMefn3qk8OsQwSTG7qI1Zqegg6CvhhBgTVIlg1kYyl + ZieGJNRmSdhf JBaRe3F3qDPOwZlhKigC7BwegoO + SzREY0O9Hs1nnl1cpTPFLw + fxipXutajFe3EaSKI0kdVXgnQ MQBXjXJxwxIGzqJdsaqMzWSXP3orVkS70pLsqFkjVG79HIDKK9uTVFcrxemZi7XtYDUaLHqSKyE0 fPmP0P0SzLeTdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirxX / AJy2 / wDJ WQ / 9tO3 / AOTc2Kvk7ULyzk0qK2imDyRGOo4sKhVKmlQPHMfHAiRJD0fa + sw5dPhhCXFLGKO0u4Dq B3KkOpWVzp31e / k4yfZ5cWY / CPhk2HXenv8ATkTjMZXFs0 + vw59IcOolwyj9EqJ + 4h4e73O0y + 0 + 3sJLWeavN5QSgf7DoEqCV9q9McsJGQICOydVpoafJiyz4eM9xPx5KYi8tgEC4nAYUYA9RWu / 7vxG Hiy9w / Hxa / ynZv8Aq8v9Kf8AiUTYXul2FxcBJR6TGBo / tNXihLVIH8zZHJCcgNt93I7L1Ok0 + XKD P93IVE0ST8h + pDLF5bU1W4nBoRUGmxFD / uvwyXFl7h + Pi4 / 5Ts3 / AFeX + LP / ABKrbyaRZ3aywzfu mhoa8mYsXPWi7UCjwwTE5Roje3J7M1Gk0mqMhO8fBVkHc2OleS2YeXJp3maeUNIxdhvxqxr / AL7r TCDlA5D8fFolpezSbOaX + IP / ABKlq + pwSxJaWn9ylKtuAQooqiu9B7 / 7csWMg2ebR2p2nDLCOHCK xQ7 + ZPf9 / wA36O5e6J2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KsF / OjW NB0vyPNNrejxa5ayzxRR2Ex4oZTVlctRivHiem / bvlWXJwB2PZfZ / wCbzeHfDtdvC1n0BgGX8noy p3BAvKEf8i8x / wAzLyd // od03 + rj7P1qN5qnlOxh9e9 / KW3tYQQPVmN1GtT0HJkAx / My8mUPZnBM 1HNZ8q / W1Y6v5Rv4jNYflPbXcKtwaSBrmRQwAJUlEIrQjH8zLyTk9mMEDUs1HzofpRHq6D / 5Z1P + BvP + qeP5mXk1 / wCh4Tf6uP8AY / rWm88tC8nsh + UVu13a8PrVuhuWeIyLyUSKqEqSOxx / My7k / wCh zT8Il43pPI7b + 7dd6ug / + WdT / gbz / qnj + Zl5I / 0O6b / Vx / sf1tSXPl2O4Fs / 5QwC5MSz + hW6Mgic kK5QJyAYrtUY / mZeSR7OaYi / HFXV7c / m36ug / wDlnU / 4G8 / 6p4 / mZeSP9Dum / wBXH + x / WhLPzx + X enapDJN + WlhDLbSqzKZZOaMpr9iRCtR4MMRqj5N / + hKBjccn2bfe + uMzXiXYq7FXYq7FXYq7FXYq 7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq8o / 5yW / 8AJdxf9tCD / iEmY2q5D3 / oL0nst / jX + Yf0 NanafmRdflp5LHkeYxXQ0 + 0N63OFKobWPj / fe / hgmJ8MeHuTinpI6vN + YFjjlXP + ce5V8nP5 + 0nT tUk / NTULM6E9uVSO4aAuSa81JjADKybcSSTtTBAyF8f0sNcNNknEaKMvEvpf6WL / APOPkd3L5M84 x6TOtrdyMy6fcymixSGBxE7mj0CtQnY5DT3UvcP0ux9pDEZ8JmLj1HfuLU9et / zt0LQtQ1m9862c 0NjEJPRsys0rlpFQCjQRAD461qflglxAXxfay08uz82SOOOCQMj / ABbDl / WLX / OO + uajrnnbzFqm pSCW9urSFp5AoUMysqV4rQDZe2HTn1 / A / oX2m08MOnxwhtESNIu40b88rS1ubu6882DQWsE1xIts 4llYRRs / FEa3jBrxp9rbrjLiAJ4vta45 + zpERGCdkgb7Dc / 1iln5Ceadc8yfmXeX2s3h2q8TRZIP WKqhZEuoSvIIFFRypWmS05JlZ7nI9otJjwaQRxio + Jf + xkw / UPzp / M2y1u8WHW39OG4lRInigdeK uQBRoz2GURyy527Ph3FpJ4xcOYHU / rZZ + Z4s / Nv5R6J5 + uLdLfXTJ9XuZIlCiVRI8Lhuppyi5JU7 bjLMm8RLq63sni02unpgbx8x5bA / p3fRmZ7wrsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdi rsVdirsVdirsVeUf85Lf + S7i / wC2hB / xCTMbVch7 / wBBek9lv8a / zD + h5z + ZnmzQL / 8ALryppmka zFPqOjQQQXsEPrIxK26RMVLIgYBk8cxss4yEfJ3vZWjyw1WWeSBEZkkXX84nvV / LnnXyr5p / LS48 reeNRS0vbBgNG1CUSSSCin02PBW + x9g77qfauETBjwnpyYarQZtPqxm08eKMvqjt8fnz97vyh8we StK8p + adB8w61FaLqzSWiSRLK5aJoWiaWP8AdnY8 / h5D5jDinEXfUL21ptRkz4suKBlwUenO7o7q CeTfyHjDBPPF2gdeLhY2HJSa0NIdxtkah4 / YWZ13aR54I / j / ADk0 / LLXfy68l + evMHo62n6Ca1s4 rC6lEjvO7RpJK3wJtxk5VBpTpk8coxld7U4 / aun1Wq02O4fvOKVjbbcgde5K4vJv5DxPzi88Xcbg EBljZTRhQioh7g0yFQ7 / ALC5B13aR2OCP4 / zk08haj + V / knz + 11p + vifRpdFaKS8mDs7Xcl5yKcE jHHjFCvUeB75ZjnGMue1dzj9o49Zq9NUsdZBk5D + bw + / vKU3XlH8jp76e8uPPExSaR5pI47Zw3xE tRT6b + PhlYjD + d9hcmGt7REREYBttz / agPzO / Mby9f8Al3TvJnlGKSPy9ppDvcTAq8zrXjQh5qVZ mYmlT2FMM5AgAcg3dldmZYZZajOR4sug6Pq7Ni + buxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Ku xV2KuxV2KuxV2KuxVIvOv + Ef8PT / AOLPQ / QtU9X6xXjy5fBx4 / Fyr0475Xl4a9XJzNB4 / ijwL8Ty eW / 9Yuf8uv8A0 / Zi / ufP / ZPQ / wCvH9L / AGLv + sXP + XX / AKfsf3Pn / sl / 14 / pf7F3 / WLn / Lr / ANP2 P7nz / wBkv + vH9L / Yu / 6xc / 5df + n7H9z5 / wCyX / Xj + l / sXf8AWLn / AC6 / 9P2P7nz / ANkv + vH9L / Yu / wCsXP8Al1 / 6fsf3Pn / sl / 14 / pf7F3 / WLn / Lr / 0 / Y / ufP / ZL / rx / S / 2Lv + sXP + XX / p + x / c + f + yX / AF4 / pf7FXsv + hY / rcPofUvW5j0 / U + t8OVduXqfBT / W2w / ufxxMZ / yvwm + Kv839D / AP / Z

uuid: 3EEF869D668911DB845A8F7E52C46FFBxmp.

н.о.р.: 018011740720681197A5EA5BBBF06064xmp.did: 018011740720681197A5EA5BBBF06064uuid: 784B2609A1BF11DD984BDCD5A91211C1uuid: 3EEF869D668911DB845A8F7E52C46FFBuuid: 3EEF869D668911DB845A8F7E52C46FFB

convertedfrom применение / приписка к применению / vnd.adobe.illustrator

преобразовано из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator

преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator

преобразован из application / postscript в application / vnd.adobe.illustrator

savexmp.iid: 018011740720681197A5EA5BBBF060642010-04-12T10: 12: 24-04: 00 Adobe Illustrator CS4 /

преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator

преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.

adobe.illustrator

преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator

преобразован из application / postscript в application / vnd.adobe.illustrator

преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator

1FalseFalse9.86.8Inches
ITCAvantGardeStd-BkOblITC Avant Garde Gothic StdBook ObliqueOpen TypeOTF 1.018; PS 001.001; Core 1.0.31; makeotf.lib1.4.1585FalseITCAvantGardeStd-BkObl.otf
bl.otf
Голубой
пурпурный
Желтый
Черный
PANTONE 123 C
PANTONE 485 C
PANTONE 534 C
Группа образцов по умолчанию 0
Белый CMYKPROCESS0. 0000000.0000000.0000000.000000
ЧерныйCMYKPROCESS0.0000000.0000000.000000100.000000
80% черный CMYKPROCESS0.0000000.0000000.00000080.000000
60% черный CMYKPROCESS0.0000000.0000000.00000060.000004
40% черный CMYKPROCESS0.0000000.0000000.00000039.999996
20% черныйCMYKPROCESS0.0000000.0000000.00000019.999998
Красный M = 100 Y = 100CMYKPROCESS0.000000100.000000100.0000000.000000
75% красный M = 75 Y = 75CMYKPROCESS0.00000075.00000075.0000000.000000
50% красный M = 50 Y = 50CMYKPROCESS0.00000050.00000050.0000000.000000
25% красный M = 25 Y = 25CMYKPROCESS0. 00000025.00000025.0000000.000000
Зеленый C = 80 Y = 100CMYKPROCESS80.0000000.000000100.0000000.000000
75% зеленый C = 60 Y = 75CMYKPROCESS60.0000040.00000075.0000000.000000
50% зеленый C = 40 Y = 50CMYKPROCESS39.9999960.00000050.0000000.000000
25% зеленый C = 20 Y = 25CMYKPROCESS19.9999980.00000025.0000000.000000
Синий C = 100 M = 50CMYKPROCESS100.00000050.0000000.0000000.000000
75% синий C = 75 M = 37,5 см MYKPROCESS75.00000037.5000000.0000000.000000
50% синий C = 50 M = 25CMYKPROCESS50.00000025.0000000.0000000.000000
25% синий C = 25 M = 12,5 см MYKPROCESS 25. 00000012.5000000.0000000.000000
Оранжевый M = 50 Y = 100CMYKPROCESS0.00000050.000000100.0000000.000000
75% оранжевый M = 37,5 Y = 75CMYKPROCESS 0,00000037,50000075,0000000,000000
50% оранжевый M = 25 Y = 50CMYKPROCESS0.00000025.00000050.0000000.000000
25% оранжевый M = 12.5 Y = 25CMYKPROCESS0.00000012.50000025.0000000.000000
Фиолетовый C = 50 M = 90CMYKPROCESS50.00000090.0000000.0000000.000000
75% фиолетовый C = 37,5 M = 67,5 см MyKPROCESS 37,50000067,5000000,0000000,000000
50% фиолетовый C = 25 M = 45 CMYKPROCESS 25.00000045.0000000.0000000.000000
25% Фиолетовый C = 12,5 M = 22,5 см MyKPROCESS12. 50000022.5000020.0000000.000000
Лазурный C = 80CMYKPROCESS80.0000000.0000000.0000000.000000
75% Azure C = 60CMYKPROCESS60.0000040.0000000.0000000.000000
50% Azure C = 40CMYKPROCESS39.9999960.0000000.0000000.000000
25% Azure C = 20CMYKPROCESS19.9999980.0000000.0000000.000000
Желтый CMYKPROCESS0.0000000.000000100.0000000.000000
75% желтый CMYKPROCESS0.0000000.00000075.0000000.000000
50% желтый CMYKPROCESS0.0000000.00000050.0000000.000000
25% желтый CMYKPROCESS 0,0000000,00000025,0000000,000000
PANTONE 485 CSPOT100. 000000CMYK10.000000100.000000100.0000005.000000
PANTONE 485 CMYKPROCESS100.000000CMYK10.000000100.000000100.0000005.000000
PANTONE 123 CSPOT100.000000CMYK0.00000024.00000094.0000000.000000
PANTONE 123 CMYKPROCESS100.000000CMYK0.00000018.000000100.0000000.000000
PANTONE 534 CSPOT100.000000CMYK100.00000080.00000030.0000025.000000
PANTONE 534 CMYKPROCESS100.000000CMYK100.00000080.00000030.0000025.000000
конечный поток endobj 4 0 obj > endobj 5 0 obj > транслировать application / postscript2010-04-12T10: 12: 24-04: 002010-04-12T10: 12: 24-04: 002010-04-12T10: 12: 24-04: 00Adobe Illustrator CS4
256172JPEG / 9j / 4AAQSkZJRgABAgEASABIAAD / 7QAsUGhvdG9zaMAwd / 7QAsUGhvdG9zaG9 0AAAAAABAASAAAAAEA AQBIAAAAAQAB / + 4ADkFkb2JlAGTAAAAAAf / bAIQABgQEBAUEBgUFBgkGBQYJCwgGBggLDAoKCwoK DBAMDAwMDAwQDA4PEA8ODBMTFBQTExwbGxscHx8fHx8fHx8fHwEHBwcNDA0YEBAYGhURFRofHx8f Hx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8f / 8AAEQgArAEAAwER AAIRAQMRAf / EAaIAAAAHAQEBAQEAAAAAAAAAAAQFAwIGAQAHCAkKCwEAAgIDAQEBAQEAAAAAAAAA AQACAwQFBgcICQoLEAACAQMDAgQCBgcDBAIGAnMBAgMRBAAFIRIxQVEGE2EicYEUMpGhBxWxQiPB UtHhMxZi8CRygvElQzRTkqKyY3PCNUQnk6OzNhdUZHTD0uIIJoMJChgZhJRFRqS0VtNVKBry4 / PE 1OT0ZXWFlaW1xdXl9WZ2hpamtsbW5vY3R1dnd4eXp7fh2 + f3OEhYaHiImKi4yNjo + Ck5SVlpeYmZ qbnJ2en5KjpKWmp6ipqqusra6voRAAICAQIDBQUEBQYECAMDbQEAAhEDBCESMUEFURNhIgZxgZEy obHwFMHR4SNCFVJicvEzJDRDghaSUyWiY7LCB3PSNeJEgxdUkwgJChgZJjZFGidkdFU38qOzwygp 0 + PzhJSktMTU5PRldYWVpbXF1eX1RlZmdoaWprbG1ub2R1dnd4eXp7fh2 + f3OEhYaHiImKi4yNjo + DlJWWl5iZmpucnZ6fkqOkpaanqKmqq6ytrq + v / aAAwDAQACEQMRAD8Aink / yhpnmhtcu9TuriGS wk9aWZCr81k9RiSGUtyHpk1rvXI9udr5tHLHHHGMvEsb3zFfrR2focecTMiRw / t / U3aeX / yqup0t 01 + 8ikkIWMyw8VLE0FTwoPppleXXdq448RwwIHdL9rKGm0UjQyS + X7ENe / l8NN882Xl28uGltb7i 0VzEAjlH5KDQ8wCrLuMtwdveNoZ6mEalC7B33FHy6Frn2bwamOKRuMuqO1byt + WmlajPp95rN8l1 bkLKqwhgCQD1Ce + Y2l7T7Tz4xkhix8MuXq / a3ZtHo8cjGU5WPL9iVX + k + R3m0230W / ubuS5u1huv VX02SN6AFAUA6k + OZ + DVa4DJLPCEBGFxrezvz3cfJg0xMRjkZXKj7vknmv8Akr8u9Bv / AKjqWsX0 dzwEnFYlccWrTcJ7Zq9B2z2jqsfiY8WMxuvqr9Ll6jQaTDLhnOV + 79iSarp / 5dQ6XPLpmpXd3fq0 fpwyp6QKFwJOJ4Urx / 2jmz0uftGWUDLjhDHvuDe9bdXEzYtIIEwlKUtvL39E / wDMXkHyB5euIoNU 1e9jknQyRhY1eqg0 / ZXNT2f27r9ZEyxYsZANc6 / S5up7N0uAgTnIX + O5Bzfl1oWqaVcXvlDV21Ka zHKezljKSEUJ + Gqoa7bfDv45kQ9oM + DLGGsxeGJ8pA2Pjz + / buapdmYskDLBPiMehe2f84rySP8A l3fK7Flj1WZYwTUKv1eBqDwHJic2 + u + v4OHpT6finmt + evzG0nUb54vK66vpkkzxaLBbi8iueNsy xzNcusFzEPVZi8NQisin4ieNcJyUNH + Zv5jCbUEk8hzsYlaWxUS3Cq6RxoWVpPqrgl2Exj2DmiqY 15BiqqXH5jee59L0m / t / K9zphu3vPrtnc2d3fTxxW6r6J4W4h9MyM9aSbkKQgfbFUkv / AM0 / zbTy 4l9aeUpjqn1y1tWs302 + YlDatJdTFVdeCfWOKRsGYBetT0VZd5V / MLzFrmu2thceUb / TbCez + sy6 ndLLEkcw + FoGjmhiNeakDepFG40OyrOcVfGflrylYeb9f8xS6rd3EU1tNJO80ZVi3OR + XIMpNfhy vt7tjLoY4 / DjGXGa3vyYaHRQ1Ep8RI4VG30P8o5pVj / xDexctg8kFFqfE + mafTleTXdsRF + BjPul + 1lHBoia8SXy / Yo6z + XK6P5103Qbi5aey1J4xFcoAkgWR + BqDzFVP3jwyej9ovzGhyaiMeGeMGwd xsL8uf2MM3Zvh544ybjLqmOueTfy00PUpNN1DWr + O6iCl1WEMAHUMNwlOhzE0PbHaeqxDLjxYzA / 0u7bvb8 + i0mKXDKcr937Ej1rTfy + j06FtE1G6vL5ruKOaOZfSpbsr8inwAV5Bd6 / Rmz0Wo7RllIz 44Qx8BIIN + qxV791 / rcXNi0wiPDkZS4hz7t / JkfmTyB + Xfl27jtNU1i + imlj9VAkSuOPIr1VPFc0 3Zvb3aOsgZ4sWMxBr6iN / m5mp7P0uEgTnIE / juSDVdN / LWLR7yXS9Uu7rU0WM2sE0fpo1ZVD78Ny EJ75t9LqO05ZoDLjhHEb4iDZ + k1176cTLi0ogTCUjLpfv93cn2u / l / 8Al9oKWh2XV76Fr2P1YlWN ZNhStSqf5WanQ9vdoasz8LFjPAaO5H6XLz9n6bDXHKQ4vx3IZfy38ta3p9xP5Q1tr + 8tU5yWNxGY 3YU6LUIa9gaEV75cfaLU6bJGOsw + HCRoSibH6f1 + TD + TcWWJOCfFIdC9T / 5xPluP0J5gt5Gb04rq ErE1aKzIwbY9CeIr8s32uqwQ4el5EebLfOl / + c1p59s5 / LGmNqHlKG3i + u2vqWCCaUyP6vAzPFOr CNk4nmFqOh74DlJ / 5O1D8yLlrkeadKsbONbp47Z7eZg7WyoeMvpg3KsWfjsXSgJ22 + JVifmgfnqJ pl0QyGBfrTRyJ + jCxBvrn6sqiYfaFuLbqKcC9eUtKKoe7m / 5yCj136xHbmXSYHhna0gfTR66sEml tQZR6irHWWD1OXJiI2Hh52xVETL + eyaoIopHktGm9H60U030h8EKfWDFyE31f1HldUDGWigmlfTw qzHyJH5xS31U + aJZZJG1CY6YJvqgZbKimIf6IAux5CrHk1ORC14gK + bfyieJLfzc8yerEqRtJFWn JQLgla9qjNR7XxJyaYRNHilR7t4OX2GQBlvy / wB8r + Q7j8vNc1J4bbQYrHU4F9WzSeZ5kkK77ctq qaHp0zH7ch3jpcYlLMZ4pbSqIiR / b72zs6elzTqOMRmNxZtI49Y1zU / zY09tZiFvd21yluLZa8Y1 UkgAnrXly5d6 + GbWWkwYOyZjCeKEoGV99 / iqcQZ8mTWx8QUQapkPmzzD9W8w3sH + CbfUuDgfXnt + bS / CDUt6TV8Ouafsvs / j08Jfm5Y7H0iVV / snN1mp4csh5An51z + xgTW + oSecI9UmsJrO2u9UWSMT IyAerP6ipuBUgeGdXGeOOjOITjOUMVGjfKNW6bgmdQJmJiJZOvmbeleftc + pa6If8JQa1 + 5Rvrsk HqNuT8HL036fPOL7C0Xi6fi / Myw + o + kSr4 / UHf8AaOfgyV4Iybc6v9BeYebE1DUNTudXGkS6bZmO BTEYmSKLhFHDxU8VFOS / CPDO37LOPDijh8UZJ3Le7JuRl93N53Wic5nJwGEdumw2AZl + eFpdz6zp rQwySqLdgSilgDzPgM5z2KyxjgnZA9f6Hbdv45SnGgTs3 + Tuk6jpd1qWt6lC9npiWhUzTqUDfErl lBFSFVDvg9rtVjzwx4MZE8pnyG / Qj7bXsTDPGZZJjhhw9Xrf / OL8iS + RtWlQcUk1q4ZV8Abe3IGd FqomJiD0iHW4CDZH84pzrf5Qz3uo32p6Z5gudh2HVpnl1W8tWukklVWX6oq + ldQqv1eJDH8QZWDE 8QaEYreho / yc12KbUGj87amiairGXjJdLIJvTSOJxIt0DSMQRjf42HIM5DfCqmJ / LLWJfKlnpF95 jfVNStLm5uf0pqNv9YDfWrS4tDH6PrIeKrdFgPUI2p9nYKpFN + Qb / of6nY69 + jL1Lq2mgvrS1ZCk FpbC3WHe4aRmLKsvqmTkGVeNOK8VVmn / AJHebtNt71LD8wb + 3nu3M31oQuXMzsvqPKpuPTlZ1G7F Q9aEMBVWVesafamzsLa0M0lybeJIjcTNzlkKKF5yMerNSpPjir5W / KRkXXPNrOvNACWTpUCSSozS + 2oJjgA2PH + pyexPqyfjvW + RLv8ALLXtY + pL5djsL0L6loJpnnSRl3K0YgVA3oQa75T25i7U0mHj 8c5IcpVERI82Wgnpc0 + Hw + GXSzaU6hrOv6j + bOlR61CltPZXkEEdvHXgE9QMGBO7c + Va5n6fR6fD 2RkOAmUZ45Ss874a + FcqcfJmyT1kRMUYyAZR558wfU / Mlzb / AOC7fWOKxn9ISW / qM9YwacvSf7PT rmj7D7P8TSxl + bnh5 + gTqtz04hz5ufrs / DlI8ET86 / Y8x1631G51qbV30ybT7Oa4TikkbRohb7Ma 1Cj9k0pnc6GeOGEYRkjknGJ62TXV0WojOWQz4TGJI6PXPzh2r6hq1tF / hSHXuUAb61LB6pT42Hpg + nJ4V698879nNF42GR / Mywer6RKr2G / 1B6LtHNwTA8IZNudX + gvKfNy6jql6 + px6HLpVpDBGskKw tHDEF + h5fhVQCWGegdlHHgxjEcwyzMjvxXI9e8vP6wTyS4xAwiB3bBl / 50Wl1OPL5ghklC2rciil qfY60Gc77G5Yx8fiIHr / AFux7bhKXBQvb9Sn + S2iatZ61daxeQyWemQ2siSTzAxoxLK1PipUKFLE 9BkvbPW4cmCOCBE8spigNyOf33Xmx7FwTjkM5Dhjw9Xpv / OMdxFcr5vuYf7qa / SSOu3wv6hG3yOd BlxmGPHE8xED7A4eOQlKRHIyLNfOP5Z3uv8Amqx8w2Wv3GjT2aW8TLbI3KSKGSaR0LCVF / eeuBuh 6GtQ1BjtyReV / wAlfMmg3WniLzxe / omykZ5dKgjmhinRpfV4NyuZVj + 0wJjVa9etaqp / rn5Zz6t5 hj1WfWGkhFqLOaGaBDI8LTyyTRerEYVEUsU3osojrQBixYDFUF5b / J6DS9RtL68vLe6lgZ3n + r2f 1US1uHukQ / vpm4rMIHoSd4geruWKpLp / 5AT6fqNrf23mBUuLW2ito5lsgJQbeJYoZg5mYCSMLxX4 f7v4P5izas48i + Q7TykmpJbTCWO + uWlijWP0xFCGYxRGrSGRo1bh6hIqoUUAXArwOz / KP88NBl1C 10iytXtbuRvVmElowmXcD ++ IfjQnYjucu1ml0mplGWWzKHLeQr5NWDLmwgiFVL3JPpv5EfnLp2oQ 39ppUcdzbtziY3NoQG + RkpmZqMmDNjOOe8ZCjzcfFjyY5iUeYTS5 / Kz8 + bnWrfWptMtm1K1FIp / U sR2IBYBqMVrsT0zCx6LRwwSwR4vDlzFy / A83JnmzyyDIa4x5BNP8J / 8AOSv / ACzQf8jLD / mrMD / Q / wBmfzT85frcj + UdX3j5BA6r + XH / ADkDqv1X6 / p8Exs51ubc + rZDjIlabBwCPYjMrS9m6HBxeGCO OPCd5cmrNqtTkrio8JsI7 / Cf / OSv / LNB / wAjLD / mrMX / AEP9mfzT85frbf5R1fePkEJqv5e / 85Ca tZNZahp9vcWzMjlDLYgco2DD7LivTocyNL2VoNPPjxgxlv1l1a82r1OSPDKiPgi / 8J / 85K / 8s0H / ACMsP + asx / 8AQ / 2Z / NPzl + ts / lHV94 + QSvXPyw / 5yD1yH6vqNuJLetTAlzZxIf8AWEbry / 2WZ2i0 Gh00uLHGpd + 5P23XwcfUZ9TmFSlt3cnsX5EeR9d8neTJ9P1tEivbm + ku / RjcScEaKKMBmWq1 / dE7 E9ct1WUTlY7mODGYxovRsxm52KuxV2KuxV2KvmFPyl / OvQNX1b9AWttLa3szk3PO0Pqx8mK7Tnmu zbrlut0mk1Yj41ng5byFfJqw5M2Engr1JBafkP8AnHZ6hFqFtpMUdzBKJoiLm04q6tyFF9SlAe2Z 2XJhyYzjlvGQo8 + TjwxZIyEhVg2m9 / 8Alh + fl / qtnq11ptu + oWJBt5xJYqRQ1XlRhy4ncV6Zr9P2 fosOGWGHEMc + YuX4HwcjJmzzmJmuKPLkmv8Ahj / nJj / lng / 4PT / + as1 / + hvsr + Yf9NP9bkfyhq + 8 fIIDWfy8 / wCchNZtY7XUrCCeGKZLhFMtktHjrT7Lio + LcHMvR9k6DTTM8QMZGJjzlyLVm1OoyCpU d7R / + GP + cmP + WeD / AIPT / wDmrMT / AEN9lfzD / pp / rbf5Q1fePkELqnkT / nInVdPn0 + / soJrW4AEi erYr9lg43Vweq5kaXsXs7T5BkxgxnHlvLurqwy6vU5ImMiCCiV8rf85LKoVbaBVUUVQ + ngAD6coP s52WTZif9NP9bP8AP6vvHyCW63 + XH / OROt2xtdQgDWzfahjuLOJW / wBb03Xl8jmbouy + z9LLjxwq XebJ + F3XwaM + o1OUVKW3yeofkB + XfmLybouprrsaQXV / OjJbo6yFUiQirMhK / EWOwOZWrzRmRTDB jMRu9UzEb3Yq7FXYq7FXYq + QvL + hf4ifWb6 / 1W7ge0ndpZAxYFTyYsamtRxOcjr9dLDKIjES4vvf Us2UYhCMYxNhfDoXk + 4mSCDzbOZpSFjDcgCx6Cp4j8cqlrNVEWcIoKcuUCzjCAbyrqVr5xt / L17q ExjuV5xXMTMCVKsQeLE03QgjLx2hGWmOaMfp6Ft / MQlhOSMRsmd95b8p2F3JaXfmm5iuIiBJGQxI JFewPY5jYtdqZxEo4gQWiGfJIWMYpLNQsNAWXT4NL124vnurpIZyGKsiPQVCkDucysWozkSM4CPD Gw3Y5TqRlACh4JvqnlPy1pdyLbUPM9zbzlQ4RuRPE1AOwPhmHh7R1GWPFDECGjHqMkxcccSEq1Ox 8swWfLT / ADDcXt00sSCLkyEIzUcioFTTMvDn1EpevGIxot + OWQn1QAFFONW8m + XtIkjj1HzLdW7y gtGGqagGn7Ncw8HaefKCYYgacfHqpz + nHEoC78nfWtMm1Dy3rr6mLYEz25ZhJQCvw0Na + AI3y / h3 mYzEM0OC + RbYaoRkI5ICNvZv + caby7uvIN39Zmeb0dSmji5ktxT0YX4ivbk5P051OmFR + LyPtTjj HUihVwh4yZJf / m55T0zUNUtdUS + soNLdY31BrOeW2mNVWQwvbrMxWKSVI5GZVAZgN65kPNKMX52f l25vq31wi6exWZjZXZ5cUiZ + CpEzVj + sKroQHUg1UKK4qv1H85fIdp5fh22C8fUbGeWeKL6ohMjG 2QyTNxl9L4EUD4uh5LSvIYqlzfnx5TTQf07NZahDp / rxwF5FtlaklvJcGYL6 / wAUarCy1WpZtkD4 qyDyv + ZPlLzTei10G4lvf3Mszz / V54Yk9F0jaNmmSP8AeVl + yAaU + Km1VWUYq + StD0F / Nev + YXvt Vu4ZrW5eRpFbkGV5H61NduOcj2pr5afhIiJcXe + nZcowYsfDGNGI + 5qPQfIs0ixR + cZ / Uc8U5BgK npUkKPxyg63WAWcI + aTmzDc4ggNR8n6npnm + w0O71GaS21BlEN1EzK3FiV3Uk0IPUVy / D2nHLp5Z Yx9UOjdDVQnhlMRFx6JxqflHyjpd41nf + a7qC5QAtGwYkBhUdAR0zEw9panLHihiBj73Hx6nLMXH HEhKNW03yxDBajSfMNxqFzPeQwSpyKFYXD82CkCpqF37fTmXg1OoJPiYxCIiT8dm / FPISePGIgRJ + Kdav5L8raPcrbal5purad0EqowYkoSVB + EHupzC0 / ampzR4oYgRy5uPi1eXILjjiQk2r2Hk + 10q 5uLDzLcX17GI / Rt6tHWsqK5FRuQhbbMzBqNVLIBPEIx3359D + lyMUsspgSxiI / YnWqeSPLWkrbnU vM93am5XnCHBJIFK / Zr0rmHh7V1GW + DFGXC42PV5J3w44mkFN5Fj1DT5rvyr5hfU5bYVltGLK57 / AA7ggmm1V38cuj2tLHMRz4 + AHq2x1nBIDLj4b6vVP + cZLu8n8p6olxNJKIr4iNZGLcaxISBXpvnV aXkXmPauERmjQq4 / pKdefvP / AJ98veZoLbRPK0 / mHSHgT1RBBOricmQv / pSiWNVVfSAUxblmq68c y3lkfp3nLzjqHlLVdWHl2az1FIruXSrOWKU0a3t0aGOeKX6pcyPNMXUelHSgpy6MyqEPnH8xJTr8 dvoqq + m / pCSweW0ugsy2iyJbxKOYMzzy + k6slFKc1G4DFVLtI8 + / mle + Z20ubQltrOa44Wt1NYX0 cawklnaSdn9MtCkbD9kStTjxBXkVQtx + ZX5sW9xZ18sPLBw0975Y9PvS7PPBDJcRRN6nBW5yyKGa qxenxfkzgAKzbyNrHm7UX1aPzHaxW72Vz9XtXt7e4gjlVAVd1a5blIrMvJWVePEijMa0VfP35dtC lh5oadDJArsZYwaFkCyclqOlRnCdsgnJirY / tD6ZrrvHXc35Ni / L3WLx / qOk / V9QtQJYIp5pGD07 iruNjSu2R7Qlq8MfVO4S2NAfqZas6jGPVK4nuCV2Os6lqv5o2UmoQC1nt3e3FuN + CokhpyP2t2Jr mVk08MWhkIHiB3v5N08UYaY8JsHf7ky80eY9GtfMF3b3HlWO / kRlD3hIq9UBrT0m6dOuY2i0mSWG JGYxHd3fa06fBM4wRk4fL8FhkSyT + bYtQjtpILO41NWh5oVCiSbmqbfCDx7A5uDUdOYEgyGP7g7A kDFw3ZEP0M / 8867pdjrSw3XlyPVZPRRvrTmhAJb4P7t + lPHND2bpsk8VxymAvl + CHV6PDKULE + Hf l + C8 / wBXkF / r51Cz0 + Szsa249HhRYuKJGRUClOY2PfN / gHh5uCUhKXq + PM / c7TF6cfCZXLf9LK / z jgmk1LTjHGzgQvXiCf2vbNV7PyAhKz1cLsqQEZW3 + UlleWc2o6jdI1vYLCFaWQFFJVuRIr14gGuP buSMxGEd52vak4y4YjeVvWf + canjk8laq8YpG + sXDIPAGCAjOu0YIhReT9qRWojf + pj75N + Z9T8x W2pXMk / kGx8waalzcf4fhW2nFyhWRVvJZn + rXUSNcu5kjNEDqp + JmK1ynmkHH5g1v61qLS / lTbtM kMgs2ETL6lusQ9SJ5fqbgiQtccFoGYUVo151YqjZrlb3yXpeon8voNP9O4vYV0a60w30lvA1pcOs kdvAkbp688caOOPxciK7h8CpA975jsPLZdfy402 + tkvLaCfSbTRp4AzSWqzXEyRyqWMayx + j6vpb Eg8X4DmVVvLXnrzDo41G + X8ppbK4qBw0uya3uGtwyrFGzCHjP6ZPxFXG26x8QxAV7Vp89zPYW091 b / VbmWJHntSwf0pGUFo + YADcTtWm + KvmX8sSg1 / zYXHJA55L4j1JajOD9ofpx13n9D6T2h / dYvd + gKfkuL8sdd1Jre30U215EvqwR3E0siycftbF2U8fAjIdoy12CFnJxROxoAV9jLWHU4o2ZWPID9SW Xmu6vqn5o6XHqdstnJZXUcCWynkFHOvLmQOXKta06Zk49NjxaGZgeISiTfwbo4YQ0sjE3xDmnnnj zJo1j5int7nyrFqsypGWvHahaqAgf3T / AGenXMHs3R5J4RKOYwG + 34IcbRaecsYIycPl + CwC9f65 5qXUreyltbCa8hEaunFUJIolR8NfhNM3 + McGDgMhKQiev2u1gOHDwkgy4S9J / MPX9K07WoILvy1H rMjWyuLpzQqpkcen / dydKV6985vsnS5MmImOU4xxcvgN + YdPoMEpwJGTg35fLzeaeabhdWvvr2n6 VJYWkNvGssCp8ERXYnkoA41PUgZ0uih5UOGcxKRJ3vm7nSjw48MpCRJZh + ckE8v6C9ONnpBJXiCa fY8M1Hs / IDxLP8Q / S6 / smQHHff8ArUvya0zUoNZvNRmje309LZo5JZAVRmLqwFWp9kKST2 + nJe0O aEscYA3Pi / Wy7WyxMBEbyt6r / wA46TQz6V5kng / uZdWkeLt8LIpXb5Z1PZ0THGAeYAeW9pwRkxg8 / DZF5x8tfmRe + arHVPLGuR6dYQpbxXdnOzvG6rJM07eh6boWZXjUHkCd91opzYPMJF5X8o / nxpt1 p9vf + aLOfR4ZG + viRjd3LxmXl + 6lltY3DcGI / eO9KCm2wVT / AFzyx5 + vvMMdzBrEcOmNai2nW3lu LUgPPL6pSAGZBJ9XdAkxcsJFqFVajFUF5b8kee4NRtLnWNXcRBna8gg1K9uVKfWHuERfWSJf2IFL cR8Pqr9llVSqS6f + Xv5w2eo2t2fMiTCC2ijdZb ++ lja4giVFlaBkCMrbrIpPxf3hq5 + FVnHkXy35 g0RNSTV9Tl1FZrlvqBmuJrl1tlZvSZ2lC8ZChVXVBxqtaksTgV4Zbfll + c + jyaja6do0E9peSuZJ TPakSIagU5yowWh7gHNFn7KGUxlIG48t30I9r6DIImUyCB3S / UlGmfkz + cWmajFqFpoYS4hYslbq z47gilPX6b5kZtEckDCQ2Lk5O3dDOPCZ7f1Zf8Smc / 5c / nfNrUOtPoEA1CAELKs1mK1HEFgJ9yB0 zGj2QBiOLfgPm0Dtbs8QMPEPCfKX / Epn / h4 / AJyG / wCrNB / yNsv + q + Y3 + hzF3H5tP5 / s3 + eflL / i UFqfkX89tTFr9b0KFzZzrcwkT2Y + NAaVpPQjfLsPYkMd8IPqFHdtx9qdnQush4Fcpf8AEo3 / AA7 / AM5Df9WaD / kbZf8AVfKf9DmLuPzavz / Zv88 / KX / EoXUvJX586laG0u9DgeEsj0E9mDWNw46T + K5Z h7ChjlxRBv397Ph3l2dA2Mh + Uv8AiUV / h4 / nIb / qzQf8jbL / AKr5X / ocxdx + bD8 / 2b / PPyl / xKXa 15A / P3WLc211pnG2b7cUVzZRhv8AWpNUj2rmRp + xceE8UY7 + ZbsPavZ2M2J7 / wBWX / EvW / yN8m65 5T8nTWOtRLBe3N7JdegrrIURo44wGZCy1 / dV2ObnBExG7y / b + ux6nOJYzcRED7Sf0vQsudG7FXYq 7FXYq7FXzXH + W / 5y6FrGrnRdJguLe9uHb6yZrUiSPkxWgklRwKN0K5otV2SM9cYPp5bvfjtbQ5cc OOZBiOVS / QCkNh + TP5wWGpxaja6Esc8EnqxD61acQa1Ap6 / T2zIy6I5IGEhsRTmT7d0M48JybH + j L / iU1vvy9 / PC91i11efy / bm / syDFKs1ktafZ50n + Lj2zFxdjRhjOMXwS83Hh3r2fGBgMh5T5S / 4l Nv0N / wA5F / 8AVng / 5G2X / VfMT / Qzh7j82j852Z / PPyl / xKA1jyX + fWsQW8N9ocDpbXEd1Fxns1PO IMADSfdTz3y / T9hQwkmAO8THn3tuLtLs7GSY5DuK5S / 4lH / ob / nIv / qzwf8AI2y / 6r5R / oZw9x + b V + c7M / nn5S / 4lDal5V / P / UrCaxvNCt5bacBXX1rMdGDdpx / Llmh3ex45icQQR5s8ev7NhISGQ2PK X / EohdE / 5yJVQq6NbhQKACWy6D / nvlZ9msPcf9Mw / Odmfzz8pf8AEpfrfkr / AJyD1i1a0utNEds4 pLFDcWUYceDETciPatMyNN2Fiwy4ox9XmbbsPaXZuM2J7 + Yl / wAS9N / IfyT5h8qeW762123W1urq 7MqQCRJSEEaqCWjLruQe + brBAxu3nPaHX4tTlicZsCNd3Xzel5kOgdirsVdirsVdir5S / L7y15g / ME + YL + 687X + lTaVKJLsuJJYzFLzYOHFxDxp6T1XjQClD2G2yzGOhwg24MImZPqIR8PkTTLyZLXTf ziS4vZmCwQO0kQdj0UN9abc9hTfInKRzx / j5JEL / AI / x82OzeU / Pun / mPY + Sdb8xXtpJfsog1CCW adGSUMI5FRpISVLrxapFN + tN7fEgYGQDDhmJ8JLKdT / LzS9LvprDUPzhe1vbc8ZoJElDqSAaEfW / A5VHMSLGP8fJmcdc5 / j5sc8waPFYXejW2kfmRca5 + k7xbS5e2aQNbq5UBzH9Zbn9rb4l6dcshK7u FUxlGqqV7sp1v8sLXQr36jrH5uSWN5wEnoTJKrcWrQ0 + t96ZVHOZCxD8fJmcdc5 / j5sb8zaLpuka LLqGn / mjNrU8UkStZ2zOkvCSQK7qDctz4rvx2 + YyyEiTRhX49zCQoXxWyjXvyoTy / PFb61 + bM2nz TL6kUc8cqllBpUD630rlUM / Fyh + PkzliI5z / AB80j8wflv5yg0G417yr53bzTptmvO7 + q3MqTIoX kx9NZZh8IG45cvbLIZo3Uo8JYyxyqxK3qH / OM + sarqnkC6k1K7mvJLfUpoIZJ3aRljEEDhAzEmgZ 2OYmtiBPbubtNImO7NJfzK8hQapqGl3eu2lne6W8cV6l3ILZFeVeaKsk3COQ8eoRjTvTMRyF0f5j / l + / 1qnmPTVWz4G5d7qFFVZFjZH5MwVkYToA4PGppWu2Kql75 + 8oWYsy + pRzi / eeO0Nor3YdrVeU 4rbLLT0x9qvTp1xVL7r82 / y + tdPGoz6rxsy9vEZBb3LlXvIDcwq6rEWQtCpc8gOP7VKjFU + tPMnl 28u0srTVLS4vJIhcR2sU8bytCyhhIIwxbgVYHlSm + Kpjir5V8maH5k / MbzD5kkufON9pU1hK0zkC SWIxM7jak8PAJwoF40pm2ySjjiPTbgxjKZO5CLj8kaPcSLBZ / nIkt1IQsUbmSNWY9uZujT7sHikc 8f4 + SeD + n + PmkGreT / zB0T8wNL8oax5iuov0tJEltqNvPNMhSZ / TD8Gkib4X2ZSR7V2rOOSEoGQH JgYTEgCebKtY / Law0a / k0 / Vfzeks72IKZLeVJVdQ6hlqPrfcGuVRzGQsQ / HybDjrnP8AHzYz5s0m 00bTLa60r8zJtemmvYbWa3tmdHihlSRmm4m5cvxMYHYb7nfLcciTvCtmEhXKV7ss178qovL9zHa6 1 + bUthcSp6scU8cqsyEleQh2vpVTlMM / Fyh + PkzliI5z / HzY15l0LTdK8v32pab + akmtXtqsbRad C0kTyc5442IJuXrxVy1AO3hlsJkkAwphIUL47ZHq35WR6PFaSav + a8 + n / Xo / WtkuI5UZkoDWn1vt yyuOe + UL / HuZnERzn + Pmleq / ll5vk0a41fyf56Pmq3s1L3UNtcyRzqoUtsgmmHKin4SwJ7A5KOeN 1KPCg4pVcZWzj / nF7X9a1TQNZg1G9mvEtLiL6sZ3aRkEqMWAZiTQla0yjXQAIps00iY7si86fnfo 3lHz7Z + WNStl + pz28Vxdan64U2 / rSPGOcTJxKrwUs3q1o2ynvguSn / k78yNE81tcrYWt9A1rdPZS G4t24erGhdv3kRljUDiRV2Xeg7rVVifmf89W0OeWA6LHNLF9aLc7wxKFtr65sw5PoPRX + pH / AJ6O kY5VLBVQuv8AnIS1tteGny6OIrKOSFru + muWj9K1uAkscxT0GBc20wm9LnyAWTlx4VZVETfnpLDq g02TQlFy0xtkgF8hla4EcJ + qgGIIbgSXSIyB6A1 + LkOGFWYeRPOM / mi31WaSzitBpuoTaehhuDcr KIQrCXl6UIXkHHwblejUYEAK8U / 5xxNmNM / MM3qu1mIIDcrHTmYuF3zCVIHLjWmbLWXcK / HJw9Pz kq / ln5R / IvzXqUz6Ja6o2o6WFuk07UZo4 / WCnYr6TOCofiGqw6jtjmyZYDeqKcUccjt0SF / PGpeb vz90C6vrA6W9hdw2KWDktJH6UjFhISF + PmzV226e + WeEIYTRthxmWUJn + ZXmf8oLTz7q9vrXk2fU NSjnUXd8l9PGJG4KeQiV1UbdshhhkMBUqHuTlljEjY3eX20 + n3f5kx3ulQGDSZ9aWSyi4BBHDJdc ok4iqrRNqZlkEQo86aB9djlb2f8AO7zD + WFh52MHmTypLrOpfVYWN4l7Nbj0yW4pwjZV28cwdNDI YemVD3OTnlAS9Qt4d50vvL + peY7q88t2LafopitxBZkbxcII45ORq1ayhviJ + KtTucz8YIjUju4m Qgnbk9U / 5yv / AOUr0X / mAb / k82Ymg + k + 9ydXzDv + cV472LX9dvpKx6LHYcbuZzxgEokVk5EkLVYx IfYeGOuqgOto0gNnuZ9 / zjE0DeSdYa3FIG1u5MQ8EMFvx / DMfW / UPc3abkfez3Vvy + 8o6sgTULJp kDzyMgnuEVzdSrNKJAkiiRTJGrBXqFKjjSgzDchCD8qPy / Es0o0kB7hZVnpNcUczqVldl9Tj6jjq 9OWy7 / CtFXRflT5Dh0y00u301rexsjMbeGC5uoqG44 + ozMkqs7fu14liStBxpiqEl / JP8spdMXS3 0djp6XC3iW / 1u8CiZU9NWFJtgEJHHp7YqmGgfll5I0DUoNT0vTTFf20BtYLmWe4uHWIsW4gzySfz kV60 + HptirKMVfN3 / OO5gGv + ejcBjAIT6oT7RT1JeVK96Zs9Xyi4mn + qSz8uvKX5A + cdWkstNg1V L22UTpZajNHGLhVPxKhhZyaftDkDQ7d6ObJmgLNIxxxyOwSzXPO + o + afz48ufXdOOlHStRtrJbN2 5yApcAuzsAASWO1NqePXJRxCGE0bsIM + LIPJPPzg8yflTZfmBqFt5g8oTarqiLB698l9PAHBgQpS NHVRxWgyGnhkMBwyoe5lmlAS3G7xfXbnSr3zVc3mi2xtdIkuVa0t + NPSjJHFDSu + 3jvmbEERo83G NGVjk + gPz6178uNO8z2EXmjyxLrd69krw3Md3NbBIvVkATjGyg / ECa ++ a / SxmYnhNOXnlAEcQt4J 50v / AC1qWtfWfLGnNpulLbxAWbVdo2VaSFnJYvVv2id8z8YkB6jZcPIQT6eT03 / nJn / pj / 8AtnN / zLzG0X8Xvb9X0UP + cW7fU / 8AG1 / eRBl0yKwkS9lO0fJpEMaknbl8JI9gcdcRwgdbRpQbPczz / nGy S2kn86SWpU2r6kGgK7L6ZMpWntTKNb / D7m / T9fe9szBch3KuIBFDuD1GKuIBFDuD1GKuIB674q7F Xyt5Y0785PJcWu6Xp3k8Xceru0V9PNFPKXjUOirG8M0acaSMQQK79embaZxTomXJwojJG6HNjvlf yT + bvlrzBaa5pvlq8F3ZuXjR4pPTYEFSj8GRipBoRy3yyeTHIUS1wxzibAT7ULb84L7zxaec38jJ Fq9qwkZYra5WGaRF4o8q + uWLLt9lhWm9crBxiHDxbMyMhlxVuyiXz1 + fc0jSTfl9YSSN9p30 + 4Zj 8yZ8qGLF / OPzZ8eXuCSeZbv85 / MKaaLryLHbNpd7HfwC0tZokd4wfhlX1WLA7fZYZZAYo36ubGXi Honk / n38 / rh / UuPIFjNJSnOSwuGNB2qbg5WMWEfxH5suPL3BJ / M + o / nP5k0SbR7 / AMgwwW0zxSM1 naTwMTDIh5ufVYlWpQ0offJwGKJsSRI5JCjFNL7zr + e2oOr3 / wCXen3boOKNPp08hA60Bec0yAx4 hymfmnjy / wA0JP5r1X / nIPzFpDaO3lqTStLkUrPa6baPCsqnqHLvI1D3CkA98njjhibuz5sZnLIV T0 // AJx18r695d8jXVrrVm9jc3Goy3EcEtA / pmGGMEr2q0bdcxdZMSnt3N2ngYx3eo5it7sVdirs VdirsVfLWgaX + cPkbWfMEeleUhqC6lK8U1zLFPKjwh4p6TQywjiwetaV + WbWcscwLlVOEBOJNDmx XQvIX5s6Hr9preneWbyK6sp1ngj9KT0 / hNeDUYOUI + EjluMtllxyFEtUccwbAZJrkX5x6x5w07zb ceR0h2jTnjkDwW1yiTNCax + upmYtwpsQQabHYDK4 + EImPFsWwjIZXW7J5 / Pn5 + TyGWf8v7GWQ9Xe wuGY026m4yoYsP8AOPzZ8eXuCR + bLv8AObzPo8emX3kSO2iiu4bwNZWs0PJoQ4CSVkcsp9TsQRk8 YxRNiSJHIRRCe3Hn / wD5yAuWD3HkGymcCgaSwuXIHhU3ByAxYR / Efmnjy9yVeYdZ / OrXtAv9Fu / I UFtBfokbzWVnNDKOEqSj4jLJUEx7imShHFEg8SCchFGKOuPOH553McEd1 + Xen3KWyCOAT6fcSlFA AoC9wx7YBjxD + M / NPHl / mhLfMeuf85Ca1oz6NF5YbR9OmUxzw6ZZvD6iMKFSXeQgEbHjSo2yUI4Y m7s + aJHKRVM7 / wCcbfJ3mPy5oertrdlJYSXlxH6EMw4yFYkILFewJegzh2mSMiKbNPAxG72HMNyH Yq7FXYq7FXYq + T / I19 + dn5h4Gv3Wmeehpo0q4P1q3uC8SJHKXKMpjjZAn7txSu1MVTu08rfnXfSe hp / 5taVeXLbRwxXxdmY9BRI2O / yxVh7ap / zkFa / mJaeRNV803GnapesBb3EkhkgZXVjG6tGjEq5X j02PWlDirMLzyz + c1lcyWt7 + bulW11EaSwTXxjkUkVoytGCNjiqReZJ / zd0Q6MifmbDqj6zfpp8b 6fN68UTPSjSuq1G7dAuFWQ6j5R / O3TLj6tqX5s6bZXHEP6NxeGJ + J6NxeNTQ0wKkvmQfmvoPl271 uT81bbUIrR4EeLTp / rLKJ5liLycVBVUDV2BJ6YVT3UvJf556XIkWp / mrp9jLKOUaXN20LMK0qoeN Sd8CpL5v0X / nI / y / oMmv2nnH9PaTArPdT6bceoYkT7TsrInJV7lCab1AGKvTv + cZvN / mPzT + X93e a / evf3dtqc1rHcSAc / SEMMoDEAVo0rbnFXpsOu6JPqs + jw6hbS6taoJLnTkmja5iRgpDSQg81Uh2 3I7jxxVFCeBp3t1kUzxqskkQYc1RywRivUBijAHvQ + GKr8VdirsVdir5G8p6p + d35keZfMy6N53 / AESNLuXd7WZ5IokheRwnp + nG6hU4U3NcUpva + V / zrvJRBY / nHpF1cvtHDFqTOzMdgAFjY7n2xVh + paj / AM5E6T + YOn + R9X81XdnqOpyRx2d2Zme2kEzFEkV1XkV5jifhqO4xVmeoeUvzu026ez1H84dK sruOhe3uNQeKRQwqKo8YYVBrirH / ADhP + bvlrQbfVj + akOri41G30309LuTciP6xHNJ6srAArx9H ZQprX23VZJqnkn89dJmSDVfzc03T53XmkV1fyQuyVI5BZI1JFQd8VSPzLH + bmheV9V18 / m1a6oum JC5s9MvDcyt61zFb1YUXgq + ty5b9KU3qFU6vfJn566fFbS6j + ben2C3aCW2F3eyQF0IBqokiUnqK 4qlfmby7 / wA5K6ToE2vab53HmPTrUM122lXbTPGqDkzcWROQUbniSfamKs // AOcU / PfmrzV5c1se YdQk1KWxu4xbzzUMgWWMkoWHUArUfPFS9kbXdDXVl0ZtRthq7p6qaaZoxcmPf4xDXnx2O9MUKd55 l8uWKRve6rZ2qTPLHE01xFGHe3JEyqWYVaIoeYh3aGuKo + SeCJ4kkkVHnYxwqzAF3Cs5VQftHgjN QdgTiq / FXYq7FXzD / wA4vrava / mal27R2jJbi4kQVZYyL3myjfcLiqz8sfyh / JLzHqT6h5d8w6rq lxorR3T2BEdtK5U8k4840YqWWhIIoe4xVKp / zGTz1 / zkj5YvobGSwttOuI7CGG4ULcH0nkZjMoJ4 tzcjjXb78VTf81J / + cd1 / MHWV8z22tProlT689qV9At6SU4VcGnGnbFXjlkdHb834DolP0MfMCHT OIYD6r9dHo0DfFT06dd8UvfPz3n / ACNTzwo87W + rSaz9Tho1gVEXo8n4dWX4q1rih86fmC3lFvNd 03lAOvl70rX6kstRID9Vi9X1K / t + tz5dq9NsUvY / + cyP + Up8vf8AMDL / AMnsUB3 / ADh5JqT + YPMN q3J9EaxVrqNqmh2zIFj5AjjVo / U + YxUvRf8AnFJbVfI + vLaEG1HmC7FuRuDH9XtuH / C4qyHX / wAi PKmu + ZNR1 + / v9Qe51QBbm35Wz24T0hCUSOW3k4 / Aoo1eSkBlIYA4qnXk / wDLHQvKuovqNjPcT3Ul qtk7zrbCsSSGRT + 4hh + KrHk37fV + TfFirLsVdirsVdir5Y / 5xeWBvNH5jrOxSAxkSuu5CGafkR9G KSgfy1 / Jj8hfOeryQaJ5n1W + nsFFxNYyIlrI8daVRmjBoGoGK7io6VriqG8zfmVH54 / 5yM8nmHTp 9Nh0XUbew9G7AW4Mi3VZDIilglG241PTFWQ / nfP / AM4 + p + Y + или 5xt9bk18R2 / wBZexMfoFfQT0 + P J1P2KV264q + ffMjeXG893B8tAjQTdx / o4EEN6Pw8eXLfl4 ++ KX07 / wA5FzfkonmrTR59g1aXUvqI Nq2mlBH6HrSbNyZTy58voxQHzP8AmM / kZ / MCHySsqaF9Vh9NbmvriWh9T1a1 + Ll4bYpevf8AOXf / AEw3 / bNl / wCZWKAhP + cOJtX / AOVhalbwM50t9Ndr + P8A3XyWWMQkjpy + JgPblipel / 8AOKq2i3Hn 9bMKLRdZItgn2BGDJw4 + 3HpipTT81NL8hjzrbfpsa02pXoW7gns1spLSMIiwmN0uldSOEJcq6Nz + IDl9gFCR3WnflU + pW + jXEWv6XCY5b6ef / RILaRNStbeOSe5pV + Q + rxysvAMrtyK8fsqFHTdL / LHT PM1hK9nrp1OzvEkijuLfRw31yO0DRW8qxIkxkuEHAKd2k + MkE + oVL0Rvzh8q6XqC6MLLVJH + sXkP quY5gJra6kjuFMk1wZDxp6ijpwKqvxUQBXo2KuxV8ceSde87 / l7 / AIp0o + R9Rv5dblaG8mKzxhYk EiIIwsMik / vnPOpBqPpVYl5AX8xPJfm208w6f5d1VzbFhJa / V50E0TggxSN6TAqdq / D2qKGhClkm peZPM91 + Z1h5 / g / L6 / tLy2f1ruyjS49K4mVSqSE + hVDuOfXlTsanFDKdQ / NXUNSvJb7UfyTtr29n IM11cWLSyuQAAWd7QsdhTc4qkHmPzZq + qrpH6P8AyrfQTpWpwam66daPCLj0A1I5ClslNyN98VZH q35v6zrN39c1f8mYdSuwojFxd2bzycFqQvOS1ZqCvTFWPeavNV5rnl660e1 / KP8AQZungaS706za GVkhmWRoyyWqGjBSPY9sVZLrP5zeYNcljm1r8nY9UlhUpFJe2slwyKTUqpltWIFfDFUh8z / md + Zt / wCXJ / LvlvyG / lTS7wMt4mnWEyu6OOLqCsUaqGGzELX3xV6z / wA4q6DrWjflxdxatZTWE11qk1xB FcI0TtEYIIw / FgGALRtTFXsmKuxV2KuxV2KuxV8YeUtc8 + fll5k83W / + Cb7U5tWneCWQpcIghDyE GMxxOG5iSoavSmKWC + TrX8wPKfm + x8xaV5e1ZGsZ / VW39CcF4a0aF5BFuHQ8WPH6MUst8xea / M + s fmRpXn2P8vL6x1Swminu4YkuTHdPBT0mesFVYUAYjqB474oZXqv5w6tq969 / q35KWuoX0gAkurqx eeVgo4qGeS1ZjQCg3xVjfnDzbqWv6FHplj + U / wDh9kvre9kn0yyeFpVgDhonKWyfa57HenhirKda / OzzBrtwlzrf5NQapcRJ6cc17ZyXDqlSeKtLbMQKkmmKse8yed73WPLep6NZ / k9FokuoRJF + kNPs WimQLKkhFVtkJDBKdcVT / Ufzp8warDaRax + TsWq / UoxDavf2styyIAAQpltmpXiK0xVKNe / N38zp fL9xoXlP8v8A / CFneqyXb6bp8qyMrgqwQrFGiEhvtceQ7EYq9H / 5xB8s6 / o3lbXJ9WsJ7Bb27j + q rcxtE7iKMhmCuAeNWpXxripezan5N8oarcSXOp6Hp99cyqFlnubWGWRlUFVBd1LGisQN8UOk8m + U JL2S + k0PT3vpWZ5bo2sJldnAV2aTjyJYCjVO4xV0Xk3yjFeLexaHYR3qTvdLcpawrKJ5Kc5eYXlz biOTdTQYqvbyn5We9W + fRrFr5JROl0baEyiUO0gkD8eQfnIzcq1qSe + KprirsVdirsVdirsVdirs VdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsV dirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVfN1uPK dvNqrx + Z9e8vwvNdNemKz1dPrV8VQvqMT2dxJF6LvxkVGXmVruFwqrLc + XYtO1Qp + ZGr6Wn12Ro5 DbakBBcfXJ / UnbjK0bwPIJgfsp9j1fjB5Kqfmi18qu2k6nP5ml1uY6Naqt62n / WLqS2i1OBVJe4u YeMrzzNwHEyBeZJLrGQqlOuLod9onkuXUfMd9oz2T6reNqlzp0bTpc3V7JIZJ1ivpLiKQzQGMLHz bl9rhWgVer / l9eRTa3q6nzpeavNdSWbwq8X1a2MkQma4gsku2n5rJ6LmT0tlWgVqqSArz / znH5b8 y6rea7FLeRcki1sWzafb3PFDpVvNNET9ciWjWsC + tyortxQM3FgxVA + Y9N8vX3mG50xtQvZLpoJ9 KnElhBcpNcxTP9WIJvEYs4shbwIEBZ4kd / hpyUIjzPZaLD5o0 + dL65j1OGT0reY6fbSkX1jeXXq3 szPfRtJJLc2k8oCL8MZKhQ8lSpeiflANDsNX1 / S9NF1Ks8i3kd7cQrGksFeEBWZ555rkmFo29Sip xK / CpJGKvUMCuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KpfretQaTaxzPDLdTXEqW9raW / D1ZZZK0Rf UaOMbAsSzgUGKsV0786fIF / qemaXFdzJe6rHE9tHJbzKOc / D04ufHg7n1N / TLKvFuTCmKusfzq8g 3VlFdvc3FslxI8VqktrcNJMYlQuYliSUsFMyrt + 1t3FVXeZvzm8naDpS6ofrOoWvqNFJ9UjUMnCO OVnK3D2 / JQkyh5OR + LpiqjYfnd5Qv76ewtI7m4vLZLeSeKA2two + tUEQEsE8sLku6p8DkcmAxVEN + cvke30qx1LVJrnSodSRpbRLq1mZyikiregsyoWZWVAxBcj4QdsVVNK / OHyDrBt10a + l1Jrm5jtI xBbXFBJIyirvJGiIqhuRLMK0IFWFMVS / TPz + / LK9sre4l1CawluRK0dld206z8YSwLcY0kUh + BCc WPI / CPjquKss8tebtC8zWrXejTSz26caySW9xbirVoB68cVTQVoOxB6MtVU4xV4r + mfM8N7cNd / l np + oXh2ab9GSw29xbsmlemDFaSyNZ3KeqYyyNEHWp + ER74qubzBqkdrqrXH5Tw3TrJS4jit2U3Np 6 / GIBWs2E0qRrA3DkR1JKFCqlUZ5kluU0PS9Zs / IdlFqdxpjstncaTLqEtrcwXFoLW3ZrVFkSPg0 j04ArwBoCvEhUBcX + u29l5XVvy4stUsNTluba / tIdMa2azt7e6kFszRSiUQhxMJVEgArz + zy + FVV 8s / mB5u060Y / 8qxnh2PULoLeyadbPZJLcTMxWecSRGicftS + o9DXlxqtVU38zteab5jsbbQfJdqF 1KGfTL68l04TBoCnoQepNaMUS1T0ImeOSrNHRVVSpxVA + X31vUNUtr + Tynp1vNPcyPb3cui3FpPF cy3Ll7qR5mDittayOxIUu7Q / EC / FSqTalrfmx9RsLq7 / AC + s7ySNbGS6m / Q07ziS5SO5uo4JWYiN zPdTnkSRGyHnyeTYK9j0XRbOxjW5axsrfVp4II9RuLKFYlkaGMIFBpzMaU4xhiaLQYqmeKuxV2Ku xV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KvP8A88fOOmeVPIr6hqOi2 + vwTXMNsNOuwhgZm5OGcOkgPH09vh64 q8LP / OSKDU7LU1 / Luzj1HTvU + p3MbvG8fqh2cArCNm9Z9j3Ynqcj4ke9zf5N1P8Aqc / 9LL9SnN / z kZaGFRN + XNh9Ughe2W3Z2 + rLFNLHM6 + iYfR + KWCNq8a1UeGImD1asukzYxc4SiPMEOX / AJyP0 + W2 eNfy00uS2maVpECqY3afh6xYfV6EyeknPx4ivQYmYHMri0ebILhCUh5An7lO5 / P7RrqOGO6 / KvSJ 47ZСлуксSOsaM7SFUDW54gu7NQdyT3x8SPe2 / wAman / U5 / 6WX6kZff8AOSaXMK2F5 + XOm3VvbLFH HbuVmjjSJT6KqvoMoCLI3EDpU0648ce9hHRZpSMYwkTHnQJr3qFn / wA5E2NlPBcWf5Y6XbT2rtJb TQosbxO44u0bLbgqWGxI64 + JHvZ / yZqf9Tn / AKWX6l // AEMTaRPAV / LPSleBP9HKBCYkkqKLxg + D lx6bY + JHvYDQ5zIxEJcQ6cJv5IzT / wDnKe + 05SmneQrWzVgqstu7RAhBRQQkI + zXbHxI97P + TdT / AKnP / Sy / UiY / + cyNTjukjvPKsaRhgJ1W6cSBa70DRdadK5IG3DMSDRfT + KHYq7FXYq7FXYq7FXYq 7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq8V / 5y2 / 8AJWQ / 9tO3 / wCTc2KvmGNbt9LtxaypHNxj JaQcqrwNf2X70zAuImbfQdRh2WTSYPy5IPAL3r + EL7cXcUMr6hNE6DjR1Wiqu / IN8Kg127GuCVEj hC6Q58GOf52Q8MjkSCT3 + 9D6ACdNkEVQTLKIyQGIJjXiSOhpk8 / 1j4OB7PxkdJlEZcEr2PKtu9q + Gr2lq9w10GCU + H0IxWpA60yUeAmqaNRDV4sUsn5gS4a2jIk8wP0u8v3MlzJdzzfE7PByAAFaBx0H sMjqIgAAebb7N5J5MmWRPqMefn3qk8OsQwSTG7qI1Zqegg6CvhhBgTVIlg1kYyl + ZieGJNRmSdhf JBaRe3F3qDPOwZlhKigC7BwegoO + SzREY0O9Hs1nnl1cpTPFLw + fxipXutajFe3EaSKI0kdVXgnQ MQBXjXJxwxIGzqJdsaqMzWSXP3orVkS70pLsqFkjVG79HIDKK9uTVFcrxemZi7XtYDUaLHqSKyE0 fPmP0P0SzLeTdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirxX / AJy2 / wDJ WQ / 9tO3 / AOTc2Kvk7ULyzk0qK2imDyRGOo4sKhVKmlQPHMfHAiRJD0fa + sw5dPhhCXFLGKO0u4Dq B3KkOpWVzp31e / k4yfZ5cWY / CPhk2HXenv8ATkTjMZXFs0 + vw59IcOolwyj9EqJ + 4h4e73O0y + 0 + 3sJLWeavN5QSgf7DoEqCV9q9McsJGQICOydVpoafJiyz4eM9xPx5KYi8tgEC4nAYUYA9RWu / 7vxG Hiy9w / Hxa / ynZv8Aq8v9Kf8AiUTYXul2FxcBJR6TGBo / tNXihLVIH8zZHJCcgNt93I7L1Ok0 + XKD P93IVE0ST8h + pDLF5bU1W4nBoRUGmxFD / uvwyXFl7h + Pi4 / 5Ts3 / AFeX + LP / ABKrbyaRZ3aywzfu mhoa8mYsXPWi7UCjwwTE5Roje3J7M1Gk0mqMhO8fBVkHc2OleS2YeXJp3maeUNIxdhvxqxr / AL7r TCDlA5D8fFolpezSbOaX + IP / ABKlq + pwSxJaWn9ylKtuAQooqiu9B7 / 7csWMg2ebR2p2nDLCOHCK xQ7 + ZPf9 / wA36O5e6J2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KsF / OjW NB0vyPNNrejxa5ayzxRR2Ex4oZTVlctRivHiem / bvlWXJwB2PZfZ / wCbzeHfDtdvC1n0BgGX8noy p3BAvKEf8i8x / wAzLyd // od03 + rj7P1qN5qnlOxh9e9 / KW3tYQQPVmN1GtT0HJkAx / My8mUPZnBM 1HNZ8q / W1Y6v5Rv4jNYflPbXcKtwaSBrmRQwAJUlEIrQjH8zLyTk9mMEDUs1HzofpRHq6D / 5Z1P + BvP + qeP5mXk1 / wCh4Tf6uP8AY / rWm88tC8nsh + UVu13a8PrVuhuWeIyLyUSKqEqSOxx / My7k / wCh zT8Il43pPI7b + 7dd6ug / + WdT / gbz / qnj + Zl5I / 0O6b / Vx / sf1tSXPl2O4Fs / 5QwC5MSz + hW6Mgic kK5QJyAYrtUY / mZeSR7OaYi / HFXV7c / m36ug / wDlnU / 4G8 / 6p4 / mZeSP9Dum / wBXH + x / WhLPzx + X enapDJN + WlhDLbSqzKZZOaMpr9iRCtR4MMRqj5N / + hKBjccn2bfe + uMzXiXYq7FXYq7FXYq7FXYq 7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq8o / 5yW / 8AJdxf9tCD / iEmY2q5D3 / oL0nst / jX + Yf0 NanafmRdflp5LHkeYxXQ0 + 0N63OFKobWPj / fe / hgmJ8MeHuTinpI6vN + YFjjlXP + ce5V8nP5 + 0nT tUk / NTULM6E9uVSO4aAuSa81JjADKybcSSTtTBAyF8f0sNcNNknEaKMvEvpf6WL / APOPkd3L5M84 x6TOtrdyMy6fcymixSGBxE7mj0CtQnY5DT3UvcP0ux9pDEZ8JmLj1HfuLU9et / zt0LQtQ1m9862c 0NjEJPRsys0rlpFQCjQRAD461qflglxAXxfay08uz82SOOOCQMj / ABbDl / WLX / OO + uajrnnbzFqm pSCW9urSFp5AoUMysqV4rQDZe2HTn1 / A / oX2m08MOnxwhtESNIu40b88rS1ubu6882DQWsE1xIts 4llYRRs / FEa3jBrxp9rbrjLiAJ4vta45 + zpERGCdkgb7Dc / 1iln5Ceadc8yfmXeX2s3h2q8TRZIP WKqhZEuoSvIIFFRypWmS05JlZ7nI9otJjwaQRxio + Jf + xkw / UPzp / M2y1u8WHW39OG4lRInigdeK uQBRoz2GURyy527Ph3FpJ4xcOYHU / rZZ + Z4s / Nv5R6J5 + uLdLfXTJ9XuZIlCiVRI8Lhuppyi5JU7 bjLMm8RLq63sni02unpgbx8x5bA / p3fRmZ7wrsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdi rsVdirsVdirsVeUf85Lf + S7i / wC2hB / xCTMbVch7 / wBBek9lv8a / zD + h5z + ZnmzQL / 8ALryppmka zFPqOjQQQXsEPrIxK26RMVLIgYBk8cxss4yEfJ3vZWjyw1WWeSBEZkkXX84nvV / LnnXyr5p / LS48 reeNRS0vbBgNG1CUSSSCin02PBW + x9g77qfauETBjwnpyYarQZtPqxm08eKMvqjt8fnz97vyh8we StK8p + adB8w61FaLqzSWiSRLK5aJoWiaWP8AdnY8 / h5D5jDinEXfUL21ptRkz4suKBlwUenO7o7q CeTfyHjDBPPF2gdeLhY2HJSa0NIdxtkah4 / YWZ13aR54I / j / ADk0 / LLXfy68l + evMHo62n6Ca1s4 rC6lEjvO7RpJK3wJtxk5VBpTpk8coxld7U4 / aun1Wq02O4fvOKVjbbcgde5K4vJv5DxPzi88Xcbg EBljZTRhQioh7g0yFQ7 / ALC5B13aR2OCP4 / zk08haj + V / knz + 11p + vifRpdFaKS8mDs7Xcl5yKcE jHHjFCvUeB75ZjnGMue1dzj9o49Zq9NUsdZBk5D + bw + / vKU3XlH8jp76e8uPPExSaR5pI47Zw3xE tRT6b + PhlYjD + d9hcmGt7REREYBttz / agPzO / Mby9f8Al3TvJnlGKSPy9ppDvcTAq8zrXjQh5qVZ mYmlT2FMM5AgAcg3dldmZYZZajOR4sug6Pq7Ni + buxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Ku xV2KuxV2KuxV2KuxVIvOv + Ef8PT / AOLPQ / QtU9X6xXjy5fBx4 / Fyr0475Xl4a9XJzNB4 / ijwL8Ty eW / 9Yuf8uv8A0 / Zi / ufP / ZPQ / wCvH9L / AGLv + sXP + XX / AKfsf3Pn / sl / 14 / pf7F3 / WLn / Lr / ANP2 P7nz / wBkv + vH9L / Yu / 6xc / 5df + n7H9z5 / wCyX / Xj + l / sXf8AWLn / AC6 / 9P2P7nz / ANkv + vH9L / Yu / wCsXP8Al1 / 6fsf3Pn / sl / 14 / pf7F3 / WLn / Lr / 0 / Y / ufP / ZL / rx / S / 2Lv + sXP + XX / p + x / c + f + yX / AF4 / pf7FXsv + hY / rcPofUvW5j0 / U + t8OVduXqfBT / W2w / ufxxMZ / yvwm + Kv839D / AP / Z
uuid: 3EEF869D668911DB845A8F7E52C46FFBxmp. н.о.р.: 018011740720681197A5EA5BBBF06064xmp.did: 018011740720681197A5EA5BBBF06064uuid: 784B2609A1BF11DD984BDCD5A91211C1uuid: 3EEF869D668911DB845A8F7E52C46FFBuuid: 3EEF869D668911DB845A8F7E52C46FFB
convertedfrom применение / приписка к применению / vnd.adobe.illustrator
преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator
преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator
преобразован из application / postscript в application / vnd.adobe.illustrator
savexmp.iid: 018011740720681197A5EA5BBBF060642010-04-12T10: 12: 24-04: 00 Adobe Illustrator CS4 /
преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator
преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd. adobe.illustrator
преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator
преобразован из application / postscript в application / vnd.adobe.illustrator
преобразован из приложения / postscript в приложение / vnd.adobe.illustrator
1FalseFalse9.86.8Inches
ITCAvantGardeStd-BkOblITC Avant Garde Gothic StdBook ObliqueOpen TypeOTF 1.018; PS 001.001; Core 1.0.31; makeotf.lib1.4.1585FalseITCAvantGardeStd-BkObl.otf
bl.otf
Голубой
пурпурный
Желтый
Черный
PANTONE 123 C
PANTONE 485 C
PANTONE 534 C
Группа образцов по умолчанию 0
Белый CMYKPROCESS0. 0000000.0000000.0000000.000000
ЧерныйCMYKPROCESS0.0000000.0000000.000000100.000000
80% черный CMYKPROCESS0.0000000.0000000.00000080.000000
60% черный CMYKPROCESS0.0000000.0000000.00000060.000004
40% черный CMYKPROCESS0.0000000.0000000.00000039.999996
20% черныйCMYKPROCESS0.0000000.0000000.00000019.999998
Красный M = 100 Y = 100CMYKPROCESS0.000000100.000000100.0000000.000000
75% красный M = 75 Y = 75CMYKPROCESS0.00000075.00000075.0000000.000000
50% красный M = 50 Y = 50CMYKPROCESS0.00000050.00000050.0000000.000000
25% красный M = 25 Y = 25CMYKPROCESS0. 00000025.00000025.0000000.000000
Зеленый C = 80 Y = 100CMYKPROCESS80.0000000.000000100.0000000.000000
75% зеленый C = 60 Y = 75CMYKPROCESS60.0000040.00000075.0000000.000000
50% зеленый C = 40 Y = 50CMYKPROCESS39.9999960.00000050.0000000.000000
25% зеленый C = 20 Y = 25CMYKPROCESS19.9999980.00000025.0000000.000000
Синий C = 100 M = 50CMYKPROCESS100.00000050.0000000.0000000.000000
75% синий C = 75 M = 37,5 см MYKPROCESS75.00000037.5000000.0000000.000000
50% синий C = 50 M = 25CMYKPROCESS50.00000025.0000000.0000000.000000
25% синий C = 25 M = 12,5 см MYKPROCESS 25. 00000012.5000000.0000000.000000
Оранжевый M = 50 Y = 100CMYKPROCESS0.00000050.000000100.0000000.000000
75% оранжевый M = 37,5 Y = 75CMYKPROCESS 0,00000037,50000075,0000000,000000
50% оранжевый M = 25 Y = 50CMYKPROCESS0.00000025.00000050.0000000.000000
25% оранжевый M = 12.5 Y = 25CMYKPROCESS0.00000012.50000025.0000000.000000
Фиолетовый C = 50 M = 90CMYKPROCESS50.00000090.0000000.0000000.000000
75% фиолетовый C = 37,5 M = 67,5 см MyKPROCESS 37,50000067,5000000,0000000,000000
50% фиолетовый C = 25 M = 45 CMYKPROCESS 25.00000045.0000000.0000000.000000
25% Фиолетовый C = 12,5 M = 22,5 см MyKPROCESS12. 50000022.5000020.0000000.000000
Лазурный C = 80CMYKPROCESS80.0000000.0000000.0000000.000000
75% Azure C = 60CMYKPROCESS60.0000040.0000000.0000000.000000
50% Azure C = 40CMYKPROCESS39.9999960.0000000.0000000.000000
25% Azure C = 20CMYKPROCESS19.9999980.0000000.0000000.000000
Желтый CMYKPROCESS0.0000000.000000100.0000000.000000
75% желтый CMYKPROCESS0.0000000.00000075.0000000.000000
50% желтый CMYKPROCESS0.0000000.00000050.0000000.000000
25% желтый CMYKPROCESS 0,0000000,00000025,0000000,000000
PANTONE 485 CSPOT100. 000000CMYK10.000000100.000000100.0000005.000000
PANTONE 485 CMYKPROCESS100.000000CMYK10.000000100.000000100.0000005.000000
PANTONE 123 CSPOT100.000000CMYK0.00000024.00000094.0000000.000000
PANTONE 123 CMYKPROCESS100.000000CMYK0.00000018.000000100.0000000.000000
PANTONE 534 CSPOT100.000000CMYK100.00000080.00000030.0000025.000000
PANTONE 534 CMYKPROCESS100.000000CMYK100.00000080.00000030.0000025.000000
конечный поток endobj 6 0 obj > транслировать
% PDF-1.4 % 1880 0 объект > endobj xref 1880 81 0000000016 00000 н. 0000001975 00000 н. 0000002176 00000 н. 0000003444 00000 н. 0000003713 00000 н. 0000003800 00000 н. 0000003980 00000 н. 0000004089 00000 н. 0000004225 00000 н. 0000004287 00000 н. 0000004404 00000 н. 0000004466 00000 н. 0000004579 00000 п. 0000004641 00000 п. 0000004751 00000 п. 0000004813 00000 н. 0000004933 00000 н. 0000004994 00000 н. 0000005176 00000 н. 0000005237 00000 п. 0000005342 00000 п. 0000005434 00000 н. 0000005608 00000 н. 0000005669 00000 н. 0000005774 00000 н. 0000005866 00000 н. 0000006038 00000 п. 0000006099 00000 н. 0000006204 00000 н. 0000006296 00000 н. 0000006357 00000 п. 0000006418 00000 н. 0000006531 00000 н. 0000006592 00000 н. 0000006653 00000 п. 0000006714 00000 н. 0000006827 00000 н. 0000006888 00000 н. 0000006949 00000 н. 0000007010 00000 п. 0000007123 00000 н. 0000007184 00000 н. 0000007245 00000 н. 0000007308 00000 н. 0000007399 00000 н. 0000007508 00000 н. 0000007569 00000 н. 0000007632 00000 н. 0000007773 00000 н. 0000007988 00000 н. 0000008516 00000 н. 0000009304 00000 п. 0000009929 00000 н. 0000010631 00000 п. 0000010655 00000 п. 0000013941 00000 п. 0000013965 00000 п. 0000016976 00000 п. 0000017000 00000 п. 0000019995 00000 п. 0000020019 00000 п. 0000022655 00000 п. 0000022679 00000 п. 0000025140 00000 п. 0000025164 00000 п. 0000025488 00000 п. 0000026028 00000 п. 0000028271 00000 п. 0000028295 00000 п. 0000030908 00000 п. 0000030932 00000 п. 0000031073 00000 п. 0000031213 00000 п. 0000036344 00000 п. 0000041056 00000 п. 0000042877 00000 п. 0000045933 00000 п. 0000072321 00000 п. 0000099188 00000 н. 0000002219 00000 н. 0000003420 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 1881 0 объект > endobj 1882 0 объект > endobj 1959 0 объект > транслировать HTmLewoN, 5} 3wЪUqcɵ ب? MӤiaRS && F4_N
Яркий и быстрый красный флуоресцентный индикатор напряжения белка, который сообщает о нейронной активности в органотипических срезах мозга
Молекулярная биология для создания вариантов FlicR.
ПЦР-амплификацию использовали для конструирования ДНК-матрицы для FlicR. Синтетические олигонуклеотиды (Integrated DNA Technologies) использовали в качестве праймеров для амплификации, а полимеразу Pfu (Thermo Fisher Scientific) использовали для поддержания репликации ДНК с высокой точностью. ПЦР с перекрытием использовали для связывания CiVSD с cpmApple FP. Произвольный мутагенез выполняли с помощью подверженной ошибкам ПЦР-амплификации с использованием полимеразы Taq (New England Biolabs) в присутствии MnCl ₂ (0,1 мм) и 800 мкМ избытка dTTP и dCTP.Рандомизацию целевых кодонов проводили с помощью наборов QuikChange Lightning (Agilent Technologies). Эндонуклеазы рестрикции (Thermo Fisher Scientific) использовали для переваривания продуктов ПЦР и векторов экспрессии. Электрофорез в агарозном геле использовали для очистки продуктов ДНК от ПЦР и реакций рестрикционного переваривания. ДНК экстрагировали из гелей с использованием набора для экстракции гелей GeneJET (Thermo Fisher Scientific). Лигирование выполняли с использованием ДНК-лигазы Т4 (Thermo Fisher Scientific).
ДНК
, кодирующая первые 242 а.о. из CiVSD (VSD242), была получена путем ПЦР-амплификации домена CiVSD от датчика напряжения VSFP3.1 (Lundby et al., 2008) с использованием прямого праймера (FW-BamHI-VSD) и обратного праймера (RV-cpmApple-VSD242). ДНК, кодирующая вариант cpmApple, была получена с помощью ПЦР-амплификации гена, кодирующего R-GECO1, с использованием прямого праймера (FW-VSD242-cpmApple) и обратного праймера (RV-XbaI-cpmApple). Праймеры RV-cpmApple-VSD242 и FW-VSD242-cpmApple содержат перекрывающуюся область, которую использовали для соединения этих двух генов вместе с помощью перекрывающейся ПЦР. Праймеры RV-cpmApple-VSD242 и FW-VSD242-cpmApple также содержали два полностью рандомизированных кодона (кодоны NNK), которые связывают два гена вместе, создавая 1024 варианта.Длина VSD, амплифицированного с помощью ПЦР, варьировалась (VSD 236, VSD237, VSD238, VSD239, VSD240 и VSD241). Другие наборы перекрывающихся праймеров, наряду с праймером FW-BamHI-VSD и праймером RV-XbaI-cpmApple, использовали для связывания ДНК, кодирующей cpmApple, с более короткими VSD, как описано выше для VSD242. Это привело к созданию библиотеки из 1024 вариантов FlicR для каждой длины VSD.
ПЦР с предрасположенностью к ошибкам вместе с перетасовкой ДНК использовали для создания библиотек в следующих раундах направленной эволюции вариантов FlicR из библиотеки VSD239.Продукты ПЦР очищали электрофорезом в агарозном геле, расщепляли и лигировали в модифицированный вектор pcDNA3.1 (+), как описано ниже.
Плазмида для двойной экспрессии
E. coli и клеток млекопитающих.
Вектор для экспрессии в прокариотических и эукариотических системах был сконструирован на основе вектора экспрессии млекопитающих pcDNA3.1 (+). Чтобы облегчить прокариотическую экспрессию, с помощью реакции QuikChange (Agilent Technologies) вводили сайт связывания рибосомы E. coli (agaggaa) для прокариотической трансляции.Получившийся вектор мы назвали pcDuEx0.5. Транскрипция кодируемых генов зависит от слабой активности промотора цитомегаловируса (CMV) в клетках E. coli (Lewin et al. , 2005). pcDuEx0.5 продемонстрировал умеренную экспрессию вариантов FlicR в клетках E. coli и показал сопоставимые уровни экспрессии в клетках HeLa по сравнению с исходной pcDNA3.1 (+). Мы использовали pcDuEx0.5 в качестве вектора для скрининга библиотек FlicR. Другие векторы двойной экспрессии были разработаны ранее (Mullinax et al., 2002).
Плазмида для экспрессии нейронов.
Для экспрессии FlicR1 в нейронах FlicR1 клонировали из плазмиды pcDuEx0.5 в сайты BamHI / HindIII вектора AAV2 с использованием праймеров FW-BamHI-VSD и RV-HindIII-cpmApple. Экспрессию FlicR1 контролировали с помощью промотора синапсина I человека, который предпочтительно экспрессировался в нейронах. Последовательность 3′-посттранскрипционного регулирующего элемента вируса гепатита сурка (WPRE) использовали для усиления экспрессии. Для экспрессии канального родопсина слияние TsChR-TS-eGFP клонировали в ту же плазмиду, где TS представляет собой KiR2.Последовательность 1-трафика, используемая для улучшения мембранного транспорта канальных родопсинов. Аминокислотная последовательность последовательности TS — KSRITSEGEYIPLDQIDINV. ChR2 (h234R) -eGFP экспрессировался из лентивирусной конструкции под промотором CaMKII, описанным ранее (Hochbaum et al., 2014).
Скрининг вариантов библиотеки FlicR в
E. coli .
Генные библиотеки вариантов FlicR трансформировали в электрокомпетентный штамм E.coli Dh20B (Invitrogen). Затем клетки E. coli высевали и культивировали при 37 ° C на чашках с агаром LB с добавлением ампициллина (400 мкг / мл), чтобы получить 500–1000 колоний на чашку.Затем были получены изображения колоний с использованием настраиваемой настройки изображения, описанной ранее (Cheng and Campbell, 2006). Для скрининга яркости мутантов FlicR изображения планшетов получали с использованием фильтра возбуждения 560/40 нм и фильтра испускания 630/60 нм. Для каждого раунда случайного мутагенеза отбирали ~ 10 000 колоний (10–20 чашек). Для каждой библиотеки, созданной путем рандомизации кодонов, было проверено примерно в три раза больше колоний, чем ожидаемый размер библиотеки рандомизации. Колонии с максимальной яркостью флуоресценции 0,01% отбирали вручную и культивировали в 4 мл среды LB с добавлением ампициллина (100 мкг / мл).Затем плазмиды экстрагировали с использованием набора для плазмид GeneJET miniprep (Thermo Fisher Scientific).
Экспрессия и
in vitro спектроскопическая характеристика FlicR1.
Для очистки FlicR1 плазмиду pcDuEx0.5, несущую FlicR1, использовали для трансформации электрокомпетентных клеток E.coli Dh20B (Invitrogen). E. coli выращивали на чашках с агаром LB с добавлением ампициллина (400 мкг / мл). Колонию использовали для инокуляции 8 мл жидкой среды LB (100 мкг / мл ампициллина) и выращивали в течение ночи при 37 ° C.На следующий день 8 мл бактериальной культуры добавляли к 500 мл среды LB (100 мкг / мл ампициллина) и выращивали в течение 4 часов при 37 ° C, а затем выращивали в течение 48 часов при 25 ° C. Затем осадок клеток собирали центрифугированием и лизировали суспензией в растворе B-PER (Pierce). Нерастворимую фракцию (содержащую мембранные белки) собирали после центрифугирования и ресуспендировали в растворе 2% n -додецил-β-d-мальтопиранозида (Anatrace) в трис-буферном физиологическом растворе. Затем суспензию гомогенизировали с помощью ультразвукового гомогенизатора и центрифугировали при 4 ° C.Солюбилизированный белок FlicR1 в супернатанте использовали для измерения спектра флуоресценции на планшет-ридере Safire2 (Tecan) и спектра поглощения на УФ-видимом спектрофотометре DU-800 (Beckman).
Культура клеток.
Клетки HeLa (CCL-2; ATCC) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (Sigma-Aldrich), 2 мм GlutaMax (Invitrogen) и пенициллин-стрептомицин, и клетки инкубировали в течение 48 часов при 37 ° C и 5% CO ₂. Клетки разделяли и культивировали на покрытых коллагеном чашках со стеклянным дном 35 мм (Matsunami) до ~ 50% слияния.Трансфекцию проводили путем инкубации клеток HeLa со смесью 1 мкг плазмидной ДНК и 2 мкл Turbofect (Thermo Fisher Scientific) в течение 2 часов в соответствии с инструкциями производителя. Визуализацию проводили через 24–48 ч после трансфекции.
Клетки 293T (HEK293T) почки человека (CRL-11268; ATCC) культивировали и трансфицировали в соответствии со стандартными протоколами (Kralj et al., 2012). Вкратце, клетки HEK293T выращивали при 37 ° C и 5% CO ₂ в среде DMEM с добавлением 10% FBS и пенициллин-стрептомицина.Клетки трансфицировали 400 нг ДНК с использованием Transit 293T (Mirus), следуя инструкциям производителя. Через 24 ч клетки пересаживали на чашки со стеклянным дном (D35-20-1.5-N; In Vitro Scientific), покрытые матригелем (BD Biosciences) при ~ 10 000 клеток / см ². Измерения проводили через 48 ч после трансфекции.
Нейроны гиппокампа крысы.
Глиальные монослои крыс получали аналогично Маккарти и де Веллису (1980). Вкратце, диссоциированные клетки гиппокампа от постнатальных детенышей крыс на 0 день (P0) любого пола (Sprague Dawley; Tocris Bioscience) (Banker and Goslin, 1998) высевали на 10-сантиметровую культуральную чашку в глиальной среде (GM), состоящей из 15% FBS. (Технологии жизни), 0.4% (мас. / Об.) D-глюкозы, 1% глутамакса (Life Technologies) и 1% пенициллина-стрептомицина (Life Technologies) в MEM (Life Technologies). После достижения слияния клетки пересаживали на чашки со стеклянным дном (D35-20-1,5-N; In Vitro Scientific), покрытые Matrigel (BD Biosciences) с плотностью 3500 клеток / см ². Когда глиальные монослои снова достигли слияния, среду заменили GM с 2 мкМ цитарабином (цитозин-β-арабинофуранозид; Sigma-Aldrich). Чашки выдерживали в GM с 2 мкМ цитарабина до использования.
Гиппокампы, выделенные из крысят P0, диссоциировали с использованием папаина и высевали в среду для посева (PM) при 8000 клеток / см. ² на заранее сформированные глиальные монослои (Banker and Goslin, 1998). Через 1 день in vitro (DIV) PM заменяли на цитарабин 2 мкм в нейробазальной среде (NBActiv4; Brainbits). Затем нейроны кормили каждые 5 дней путем замены 1 мл культуральной среды на NBActiv4 без цитарабина. Нейроны были трансфицированы на DIV 9 через фосфат кальция, как описано ранее (Jiang and Chen, 2006). Измерения на нейронах проводились на DIV 14. Для полностью оптических электрофизиологических экспериментов на нейронах клетки котрансфицировали фосфатом кальция с каналом родопсином и ДНК FlicR1 на DIV 9 и измеряли на DIV 12–13.
Для измерения спонтанной активности диссоциированные клетки гиппокампа E18 Sprague Dawley в полной среде гибернации EB были приобретены у BrainBits. Клетки выращивали на чашке со стеклянным дном диаметром 35 мм (In Vitro Scientific), покрытой поли-d-лизином (A-003-E; Millipore), содержащим 2 мл NbActiv4 (BrainBits) с добавлением 2% FBS, калиевой соли пенициллина-G. (25 единиц / мл) и сульфат стрептомицина (25 мкг / мл).Половину культуральной среды заменяли каждые 3 дня. Нейрональные клетки трансфицировали на 8-й день с использованием Lipofectamine 2000 (Life Technologies), следуя инструкциям производителя. Вкратце, 1-2 мкг плазмидной ДНК и 4 мкл Lipofectamine 2000 (Life Technologies) были добавлены к 100 мкл среды NbActive4 для получения среды для трансфекции. Затем эту среду инкубировали при комнатной температуре в течение 10–15 мин. Половину культуральной среды (1 мл) из каждой чашки нейронов извлекали и объединяли с равным объемом свежей среды NbActiv4 (с добавлением 2% FBS, калиевой соли пенициллина-G и сульфата стрептомицина) для получения смеси 1: 1. и инкубировали при 37 ° C и 5% CO ₂.Затем в каждую нейронную чашку добавляли 1 мл свежей кондиционированной (при 37 ° C и 5% CO ₂) среды NbActiv4. Затем добавляли среду для трансфекции и нейронные чашки инкубировали в течение 2–3 ч при 37 ° C в инкубаторе с CO ₂. Затем среду заменяли кондиционированной средой 1: 1, приготовленной ранее. Перед визуализацией клетки инкубировали в течение 48–72 ч при 37 ° C в инкубаторе CO ₂.
Экранирование индуцированного трансмембранного напряжения.
Для скрининга индуцированного трансмембранного напряжения (ITV) варианты FlicR коэкспрессировались в клетках HeLa вместе с внутренним выпрямительным калиевым каналом, Kir2. 1 (Addgene # 32641) и ArcLight Q239 (Addgene # 36856) в качестве внутренней ссылки. Экспрессия Kir2.1 в клетках HeLa помогает поддерживать потенциал покоя ~ -60 мВ, что подходит для скрининга индикаторов напряжения нейронов. К культуре клеток прикладывали однородное электрическое поле ~ 50 В / см для создания ITV. Генератор импульсов (PG 58A; Gould Advanced) использовался для подачи прямоугольного импульса длительностью 10 мс с частотой ~ 0,5 Гц. Усилитель (6824A 40V / 25A; Agilent Technologies) использовался для получения амплитуды импульса 25 В.Пара параллельных платиновых электродов (0,5 см друг от друга) использовалась для доставки импульсов в культуру клеток. Флуоресценцию регистрировали одновременно с несколькими импульсами электрического поля для ITV с частотой кадров 100 Гц в течение 10 с.
Визуализация ITV в клетках HeLa.
Визуализацию проводили в сбалансированном солевом растворе Хэнкса с буфером HEPES (25 мм) (HBSS). Инвертированный флуоресцентный микроскоп (Eclipse Ti-E; Nikon), оснащенный металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen) и масляным объективом 60 ×, использовали для изображения клеток HeLa. Изображения были получены с частотой 100 Гц с биннингом 4 × 4 с использованием 16-битной ПЗС-камеры с электронным умножением QuantEM 512SC (Photometrics). Набор фильтров FITC / Cy2 (470/40 нм (возбуждение), 525/50 нм (излучение) и дихроичное зеркало 495LP (номер набора 49002; Chroma) использовался для изображения ArcLight Q239. Набор фильтров TRITC / Cy3 (545 / 30 нм (возбуждение), 620/60 нм (излучение) и дихроичное зеркало 570LP (номер набора 49005; цветность) использовали для изображения FlicR1. Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research (Nikon) использовалось для управления микроскопом и камерой.Необработанные флуоресцентные следы как FlicR, так и ArcLight были извлечены из идентичных интересующих областей в клетках, экспрессирующих обе конструкции, и экспортированы в настраиваемую электронную таблицу Microsoft Excel. Вычитание фона, коррекция фотообесцвечивания, вычисление среднего значения Δ F / F _мин и расчет отношений сигнал / шум (SNR) выполнялись автоматически в Excel. Среднее значение Δ F / F _мин и SNR сигналов FlicR сравнивали со значениями сигналов ArcLight от тех же ячеек, и сообщалось о соотношении Δ F / F _мин FlicR по сравнению с ArcLight .Для каждого варианта анализировали не менее 10 клеток, коэкспрессирующих FlicR и ArcLight. Был определен и секвенирован лучший вариант с максимальным средним соотношением в каждой библиотеке.
Визуализация спонтанной активности в первичной культуре нейронов.
Визуализацию проводили в HBSS с буфером HEPES (25 мм). Получение изображений в широком поле выполнялось на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti-E, оснащенном металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen), масляными объективами 60x (числовая апертура, NA = 1,4; Nikon) и 16-битным QuantEM 512SC. ПЗС-камера с электронным умножением (Photometrics).Набор фильтров TRITC / Cy3 (545/30 нм (возбуждение), 620/60 нм (эмиссия) и дихроичное зеркало 570LP (# 49005; Chroma) использовали для изображения FlicR1. Для покадровой визуализации нейроны отображались на Частота изображения 100 Гц с биннингом 4 × 4. Необработанные следы флуоресценции были скорректированы на фоновую автофлуоресценцию и фотообесцвечивание. Как видно на рисунке 5 A , FlicR1 показывает некоторые внутриклеточные точки. Все больше свидетельств указывают на то, что эти структуры являются лизосомами, в которых накапливается белок быстрее, чем разлагается (Катаяма и др., 2008).
Одновременная электрофизиология и флуоресценция в клетках HEK и первичной культуре нейронов.
Все измерения изображений и электрофизиологии были выполнены в буфере Тирода, содержащем следующие (в мм): 125 NaCl, 2,5 KCl, 3 CaCl ₂, 1 MgCl ₂, 15 HEPES и 30 глюкозы, pH 7,3. Для измерения клеток НЕК добавляли 2-аминоэтоксидифенилборат (100 мкм; Sigma-Aldrich) для блокирования эндогенных щелевых соединений. Измерения при 34 ° C выполняли перфузией в буфере Тирода со скоростью 1 мл / мин при поддержании повышенной температуры с помощью встроенного нагревателя (Warner Instruments) и нагревателя объектива (Bioptechs).
Стеклянные микропипетки с нитями (WPI) вытянуты до сопротивления кончика 4–8 МОм и заполнены внутренним раствором, содержащим (в мм): глюконат калия 125, 8 NaCl, 0,6 MgCl ₂, 0,1 CaCl ₂ , 1 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP и 0,4 Na-GTP, pH 7,3, доведенный до 295 мОсм сахарозой. Пипетки размещали с помощью манипулятора Sutter Instruments MP285. Записи целых клеток, напряжения и токовые зажимы были получены с использованием усилителя Axopatch 700B (Molecular Devices), отфильтрованы на 2 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифрованы с помощью платы сбора данных PCIE-6323 National Instruments на 10 кГц.Данные были получены только от ячеек с сопротивлением доступа <25 МОм. Чтобы определить минимальный ввод тока, необходимый для генерации потенциала действия перед визуализацией, вводили прямоугольные волны возрастающей амплитуды с шагом 50–100 пА во время регистрации напряжения. Минимальное значение тока, которое привело к устойчивой генерации AP, было использовано для генерации потенциалов действия для экспериментов по визуализации.
Освещение обеспечивалось твердотельным лазером 561 нм и 100 мВт с диодной накачкой (Cobolt Jive 100 561 нм) для визуализации FlicR1 и лазером 488 нм 50 мВт (Omicron PhoxX) для визуализации ArcLight.Луч был расширен и сфокусирован на заднюю фокальную плоскость масляно-иммерсионного объектива 60x (Olympus APON 60XOTIRF 1.49 NA). Интенсивность изображения на образце составляла 10 Вт / см ². Для полностью оптических электрофизиологических измерений в нейронах луч 488 нм был расширен и модулирован цифровым микрозеркальным устройством (Texas Instruments DLP LightCrafter Evaluation Module), управляемым с помощью встроенного программного обеспечения. Флуоресценцию FlicR1 отделяли от возбуждающего света и фильтровали с использованием дихроичного и эмиссионного фильтров из набора фильтров Cy3-4040C-OMF-ZERO (Semrock).Флуоресценцию ArcLight разделяли с помощью дихроичной лампы с длинным проходом (каталог Semrock № FF495-Di03) и фильтровали с помощью полосового фильтра 531/40 нм (каталог Semrock № FF01-531 / 40-25). Образец был отображен на камеру EMCCD (Andor iXon ⁺ DU-860) с разрешением 128 × 128 пикселей. Для измерения скорости FlicR1 фильмы были получены с частотой кадров 2 кГц с биннингом 2 × 2. Измерения чувствительности проводились при 10 Гц без объединения. Следы фотообесцвечивания получали при 2 Гц без биннинга. Нейронные данные были получены при 1 кГц с бинингом 2 × 2 или при 500 Гц с бинингом 1 × 1.
Часть скрининга условий полностью оптической электрофизиологии была выполнена на другом специально изготовленном микроскопе, оснащенном камерой с более высоким разрешением. Освещение осуществлялось с помощью 561 нм 100 мВт Cobolt Jive (номер по каталогу 0561-04-01-0100-500), 488 нм 100 мВт Coherent Obis (номер по каталогу 1226419) или 405 нм 30 мВт Dragon Laser (номер по каталогу 11042443). Лазерные линии были объединены с дихроичными зеркалами, а интенсивность модулировалась с помощью акустооптических перестраиваемых фильтров (Gooch & Housego, каталог № TF525-250-6-3-Gh28A или № 48058-2. 5-.55-5W). Линия лазера 488 нм была расширена для освещения микросхемы цифрового микрозеркального устройства (Texas Instruments DLP LightCrafter с набором микросхем DLP 0.3 WVGA), которое впоследствии было повторно отображено на плоскости образца. Линии 561 и 488 нм были сфокусированы в задней фокальной плоскости объектива APON 60XOTIRF 1.49 NA (Olympus). Коллимированный лазерный свет с длиной волны 405 нм в задней фокальной плоскости объектива был расфокусирован для получения пятна 5 мкм на образце и направлялся в плоскости образца с помощью гальвонометрических зеркал (каталог Thorlabs # GVS202), расположенных в сопряженной плоскости.Флуоресцентный свет отделяли от освещающего света с помощью четырехзонного дихроичного зеркала (номер каталога Semrock Di01-R405 / 488/561/635). Свет флуоресценции пропускали через острие, разделенное на два канала, с использованием дихроичного зеркала, которые были рекомбинированы и повторно отображены на двух половинах чипа научной камеры CMOS (Hamamatsu ORCA-Flash 4. 0). Расщепление и рекомбинация были выполнены с использованием дихроичных зеркал (Semrock FF662-FDi01). Зеленая и оранжевая флуоресценция фильтровали с использованием полосового фильтра HQ550 / 50m (Chroma) для возбуждения 488 нм или полосового фильтра ET595 / 50m (Chroma) для освещения 561 нм.Свет с длиной волны 458 нм обеспечивался светодиодом (LED Supply 07040-PR000-B), расположенным над образцом, отфильтрованным фильтром возбуждения D480 / 60x (Chroma) и управляемым четырехканальным светодиодным драйвером (Thorlabs DC4104). Электрофизиологические записи на этом микроскопе выполнялись, как указано выше, но с использованием усилителя Axopatch 200B и головного блока CV203BU (Molecular Devices). Сигналы фильтровались на частоте 5 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифровывались на частоте 10 кГц с использованием платы сбора данных National Instruments PCIe-6259.
Измерения кинетики ArcLightQ239 проводились с использованием света 488 нм от лазера Coherent Obis 488-50, сфокусированного на заднюю фокальную плоскость водно-иммерсионного объектива 60x (Olympus UIS2 UPlanSApo × 60 / 1,20 Вт, NA 1,20) до плотность энергии 2–4 Вт / см ² на образце. Флуоресцентный свет отделяли от возбуждающего света с помощью дихроичного Semrock Di01-R405 / 488/594, пропускали через полосовой эмиссионный фильтр 525/30 и отображали на CMOS-камеру для научных исследований (Hamamatsu ORCA-Flash 4.0). Регистрацию напряжения всей ячейки выполняли с помощью усилителя с коммутационным зажимом (A-M Systems Model 2400), фильтровали на частоте 5 кГц с помощью внутреннего фильтра и оцифровывали с помощью платы сбора данных PCIE-6323 National Instruments на частоте 10 кГц.
Двухфотонная чувствительность FlicR к напряжению была протестирована на самодельном двухфотонном микроскопе со сканирующим лучом и перестраиваемым импульсным лазером с частотой 80 МГц и 100 фс (SpectraPhysics Insight DeepSee). Измерения проводились при длине волны возбуждения 1120 нм со средней по времени мощностью возбуждения 60 мВт или 0.8 нДж на импульс в режиме визуализации и ∼6 мВт или 80 пДж на импульс в режиме точечной записи. Импульсы фокусировались в пятно размером ~ 500 нм с помощью водно-иммерсионного объектива 1,2 NA (Olympus UplanSapo). Измерения изображений проводились с линейной скоростью сканирования ~ 8 см / с ^-1. Свет возбуждения и флуоресценция разделяли с использованием дихроичного зеркала FF775-Di01 и короткопроходного фильтра FF01-790 / SP-25 (оба — Semrock). Флуоресценцию регистрировали с помощью фотоумножителя Hamamatsu R943-02 в режиме счета фотонов, охлажденном до -20 ° C.Сигнал ФЭУ усиливался через усилитель SRS PR325 и дискретизировался с помощью счетчика фотонов Hamamatsu C9744. Данные были получены с использованием карты DAQ NI pci-6259. Настройка контролировалась программным обеспечением Labview, написанным собственными силами.
HeLa cell для всей оптической электрофизиологии.
Визуализацию проводили в HBSS с буфером HEPES (25 мм). Использовали инвертированный флуоресцентный микроскоп (Eclipse Ti-E; Nikon), оборудованный металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen) и масляным объективом 60 ×.Изображения были получены с частотой 100 Гц с биннингом 4 × 4 с использованием 16-битной ПЗС-камеры с электронным умножением QuantEM 512SC (Photometrics). Клетки, экспрессирующие только R-GECO1, R-GECO1 и ChIEF-цитрин, только FlicR1 или FlicR1 и ChIEF-цитрин, подвергались полнопольному освещению импульсами синего света (лазер 405 нм, 20 мс, 5 Гц и 10 Гц, 5 мВт / мм ²) для стимуляции ЧИЭФ. Клетки одновременно освещали желтым светом для возбуждения флуоресценции R-GECO1 или FlicR1. Набор фильтров TRITC / Cy3 (545/30 нм (возбуждение), 620/60 нм (излучение) и дихроичное зеркало 570LP (# 49005; Chroma) использовали для изображения флуоресценции R-GECO1 или FlicR1.Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research (Nikon) использовалось для управления микроскопом и камерой. Изменения флуоресценции рассчитывали путем усреднения по всей клетке. Необработанные следы флуоресценции были скорректированы на фоновую автофлуоресценцию и фотообесцвечивание.
Различные опсины были исследованы с целью минимизировать оптические перекрестные помехи с FlicR1. Интенсивность желтого света, используемая для изображения FlicR1 в клетках HeLa при частоте сбора данных 100 Гц (60 мВт / см ²), намного ниже, чем интенсивность, необходимая для изображения переходных процессов AP в нейронах (10 Вт / см ²). Как упоминалось выше, мы использовали ChIEF в наших экспериментах по проверке концепции, потому что 60 мВт / см ² желтого света недостаточно, чтобы вызвать активацию ChIEF. Однако нам пришлось переключиться на большее количество опсинов с синим смещением (ЦЧР и ПсЧР), чтобы попытаться избежать оптических перекрестных помех с относительно более высокой интенсивностью освещения, необходимой для изображения FlicR1 в нейронах на частоте 1 кГц (см. Рис. 8).
Получение органотипических срезов головного мозга гиппокампа крысы.
Горизонтальные срезы мозга (толщиной 250 мкм) крысы P0 Sprague-Dawley любого пола получали в ледяном HBSS, содержащем 1.3 мм CaCl ₂ и 1 мм MgSO ₄ с помощью вибрирующего микротома (Leica VT1000S), как описано ранее (Panaitescu et al., 2013). Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и с одобрения Комитета по уходу и использованию животных Университета Альберты для медицинских наук. Области гиппокампа вырезали из горизонтальных срезов головного мозга и помещали на стерильную вставку для культивирования клеток с мембраной с порами 0,4 мкм (Millipore PICMORG50). Затем вставку и срез помещали в чашку Петри, содержащую 1.5 мл NbActiv4 (BrainBits) с добавлением 5% FBS, калиевой соли пенициллина-G (50 единиц / мл) и сульфата стрептомицина (50 мкг / мл). Срезы культивировали при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение 3–5 дней перед трансфекцией.
Ex vivo электропорация органотипических срезов головного мозга.
Вставка Millipore и культивированный на ней срез помещали между платиновым пластинчатым электродом Петри (CUY700-P2E; Nepa Gene) и квадратным платиновым электродом (CUY700-P2L; Nepa Gene).Зазор между чашечным электродом и мембраной заполняли буфером для электропорации (HBSS с 1,5 мМ MgCl ₂ и 10 мМ глюкозы). Плазмиду pAAV2-hSyn-FlicR1 растворяли в буфере для электропорации при концентрации 1 мкг / мкл и добавляли достаточный объем, чтобы заполнить зазор между срезом и верхним электродом. Пять импульсов 20 В (5 мс каждый, 1 Гц) подавали с помощью функционального генератора (PG 58A; Gould) и усилителя (6824A; Agilent Technologies). Затем направление электрического поля было изменено на противоположное, и был применен второй набор из пяти импульсов с такими же настройками.После трансфекции срезы возвращали в инкубатор при 37 ° C с 5% CO ₂. Обычно для полной экспрессии FlicR1 в культивируемых срезах мозга с использованием этого метода трансфекции требуется 2–3 дня.
Визуализация органотипических срезов гиппокампа крыс.
Для получения изображения органотипических срезов головного мозга использовали вертикальный конфокальный микроскоп FV1000 (Olympus), оснащенный программным обеспечением FluoView1000 (Olympus) и водно-иммерсионным объективом 20 × XLUMPlanF1 (NA 1.00; Olympus). Освещение осуществлялось ртутной дуговой лампой мощностью 100 Вт (Olympus).
Срез мозга на вставке Millipore был помещен в специально изготовленную камеру, чтобы удерживать его на месте во время визуализации. Непосредственно перед визуализацией срезы перфузировали суперфузатом искусственного спинномозговой жидкости (ACSF), содержащим следующее (в мм): 120 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl ₂, 2 MgSO ₄, 26 NaHCO ₃, 1,25 NaH ₂ PO ₄ и 10 d-глюкоза, pH доведен до 7,4 путем газирования 95% O ₂, 5% CO ₂ при 5 мл / мин с использованием перистальтического насоса (Watson-Marlow Alitea) и температура буфера поддерживалась на уровне 34 ° C.Визуализацию начали через 10 мин после активации перфузионной системы.
Для получения изображения FlicR1 срез гиппокампа возбуждали ртутной дуговой лампой мощностью 100 Вт с использованием куба-фильтра с фильтром возбуждения 565/30 нм, эмиссионным фильтром 620/50 нм и дихроичным светом 585 нм (Semrock). Изображения были получены с частотой 100 Гц при биннинге 2 × 2 (см. Рис. 6 B , спонтанная активность) и 50 Гц (см. Рис. 6 E , стимулированная активность) с помощью цифровой камеры sCMOS (Hamamatsu Orca-Flash3. 8). ; Hamamatsu Photonics).Для стимуляции теофиллином, примерно через 30 с после начала эксперимента, суперфузат меняли с контрольного ACSF на ACSF, содержащий 10 мМ теофиллина (Sigma-Aldrich, непосредственно растворенный в ACSF). Примерно через 10 минут суперфузат был снова заменен на контрольный ACSF. Были отображены четыре органотипических среза мозга, трансфицированных FlicR1, и они показали аналогичные ответы. На рис. 6 показаны репрезентативные следы флуоресценции нейронов в органотипических срезах.
Анализ данных.
Для измерения скорости и чувствительности в клетках HEK следы флуоресценции извлекали с использованием алгоритма взвешивания пикселей максимального правдоподобия, описанного ранее (Kralj et al., 2012). Вкратце, флуоресценция каждого пикселя коррелировала со средней флуоресценцией всего поля. Пиксели с более сильной корреляцией со средним значением предпочтительно взвешивались при измерении флуоресценции, делая акцент на пикселях, содержащих наибольшее количество информации. 5% пикселей с наибольшей корреляцией со средним значением были использованы для характеристики скорости и чувствительности белка. Флуоресцентные ответы на ступенчатые функции были усреднены по 100 испытаниям и соответствовали двойной экспоненциальной функции для получения постоянных времени флуоресцентного ответа FlicR1.Чувствительность определялась как максимальное процентное изменение флуоресценции при изменении напряжения на 150 мВ.
Следы фотообесцвечивания были получены путем вычитания средней флуоресценции области заданной пользователем фоновой области из средней флуоресценции заданной пользователем области клетки. Затем полученные следы были подогнаны к одной экспоненте со смещением базовой линии, чтобы получить постоянную времени фотообесцвечивания. FlicR1 показал кратковременную фотоактивацию в первые 100 с, которую не принимали во внимание при расчетах фотообесцвечивания.
Для измерения нейронов тело клетки и дендриты были выбраны вручную, и средняя интенсивность всех включенных пикселей была усреднена. Интенсивность фона заданной пользователем области фона была вычтена из необработанного сигнала. Базовая линия фотообесцвечивания была построена из интенсивности всего поля с помощью скользящего минимального фильтра, за которым следовал скользящий средний фильтр. Затем каждый кадр фильма корректировался путем деления на эту базовую линию. SNR рассчитывали как максимальный отклик флуоресценции на потенциал действия (как определено записью патч-кламп), деленный на SD базовой флуоресценции.
Данные были проанализированы с использованием пользовательских кодов MATLAB и Microsoft Excel. График Q – Q использовался для проверки нормальности сравниваемых наборов данных. Оба набора данных были определены как имеющие одинаковую дисперсию с использованием теста F (α = 0,05). Если не указано иное, приведенные значения являются средними ± SEM. Статистический метод не использовался для обоснования размеров выборки, но размеры выборки аналогичны тем, которые используются другими в этой области. Критерии отбора данных для экспериментов указаны в разделе «Материалы и методы» для каждого эксперимента и аналогичны критериям, используемым другими в этой области.
% PDF-1.7 % 4907 0 объект > endobj xref 4907 233 0000000016 00000 н. 0000007188 00000 н. 0000007383 00000 н. 0000007421 00000 п. 0000008666 00000 н. 0000008704 00000 н. 0000008845 00000 н. 0000008985 00000 н. 0000009332 00000 н. 0000009659 00000 н. 0000009787 00000 н. 0000010499 00000 п. 0000010612 00000 п. 0000010727 00000 п. 0000010766 00000 п. 0000011583 00000 п. 0000011803 00000 п. 0000013421 00000 п. 0000013787 00000 п. 0000014334 00000 п. 0000014737 00000 п. 0000015060 00000 п. 0000015398 00000 п. 0000017078 00000 п. 0000017362 00000 п. 0000017992 00000 п. 0000018339 00000 п. 0000018970 00000 п. 0000019527 00000 п. 0000019617 00000 п. 0000019932 00000 п. 0000021464 00000 п. 0000022229 00000 п. 0000022617 00000 п. 0000022646 00000 п. 0000022780 00000 п. 0000023317 00000 п. 0000024732 00000 п. 0000026011 00000 п. 0000026126 00000 п. 0000027266 00000 п. 0000028390 00000 п. 0000028806 00000 п. 0000030627 00000 п. 0000032512 00000 п. 0000032812 00000 п. 0000033135 00000 п. 0000033403 00000 п. 0000033740 00000 п. 0000034138 00000 п. 0000036788 00000 п. 0000039347 00000 п. 0000039418 00000 п. 0000039520 00000 н. 0000044987 00000 п. 0000048679 00000 н. 0000048945 00000 п. 0000049218 00000 п. 0000050766 00000 п. 0000057250 00000 п. 0000058370 00000 п. 0000058824 00000 п. 0000058847 00000 п. 0000058870 00000 п. 0000058946 00000 п. 0000059110 00000 п. 0000059524 00000 п. 0000059600 00000 п. 0000059782 00000 п. 0000060196 00000 п. 0000060272 00000 п. 0000060436 00000 п. 0000060849 00000 п. 0000060925 00000 п. 0000061107 00000 п. 0000061523 00000 п. 0000061599 00000 п. 0000061763 00000 п. 0000062173 00000 п. 0000062249 00000 п. 0000062431 00000 п. 0000062846 00000 п. 0000062922 00000 п. 0000063086 00000 п. 0000063499 00000 п. 0000063575 00000 п. 0000063755 00000 п. 0000064167 00000 п. 0000064243 00000 п. 0000064417 00000 п. 0000064829 00000 п. 0000064905 00000 н. 0000065073 00000 п. 0000065485 00000 п. 0000065561 00000 п. 0000065637 00000 п. 0000065801 00000 п. 0000066217 00000 п. 0000066293 00000 п. 0000066469 00000 п. 0000066887 00000 п. 0000066963 00000 п. 0000067209 00000 п. 0000067636 00000 п. 0000067993 00000 п. 0000068069 00000 п. 0000068245 00000 п. 0000068659 00000 п. 0000068735 00000 п. 0000068899 00000 н. 0000069311 00000 п. 0000069387 00000 п. 0000069565 00000 п. 0000069976 00000 п. 0000070052 00000 п. 0000070220 00000 п. 0000070633 00000 п. 0000070709 00000 п. 0000070889 00000 п. 0000071302 00000 п. 0000071378 00000 п. 0000071548 00000 п. 0000071960 00000 п. 0000072036 00000 п. 0000072218 00000 п. 0000072630 00000 п. 0000072706 00000 п. 0000072878 00000 п. 0000073289 00000 п. 0000073365 00000 п. 0000073549 00000 п. 0000073961 00000 п. 0000074037 00000 п. 0000074211 00000 п. 0000074623 00000 п. 0000074699 00000 н. 0000074775 00000 п. 0000074939 00000 п. 0000075355 00000 п. 0000075431 00000 п. 0000075607 00000 п. 0000076025 00000 п. 0000076101 00000 п. 0000076367 00000 п. 0000076793 00000 п. 0000077150 00000 п. 0000077226 00000 п. 0000077394 00000 п. 0000077807 00000 п. 0000077883 00000 п. 0000078047 00000 п. 0000078460 00000 п. 0000078536 00000 п. 0000078704 00000 п. 0000079117 00000 п. 0000079193 00000 п. 0000079363 00000 п. 0000079777 00000 п. 0000079853 00000 п. 0000080025 00000 п. 0000080438 00000 п. 0000080514 00000 п. 0000080688 00000 п. 0000081102 00000 п. 0000081178 00000 п. 0000081354 00000 п. 0000081769 00000 п. 0000081845 00000 п. 0000082023 00000 п. 0000082435 00000 п. 0000082511 00000 п. 0000082691 00000 п. 0000083103 00000 п. 0000083179 00000 п. 0000083361 00000 п. 0000083773 00000 п. 0000083849 00000 п. 0000083925 00000 п. 0000084089 00000 п. 0000084505 00000 п. 0000084581 00000 п. 0000084753 00000 п. 0000085171 00000 п. 0000085247 00000 п. 0000085493 00000 п. 0000085919 00000 п. 0000086276 00000 п. 0000086352 00000 п. 0000086536 00000 п. 0000086948 00000 н. 0000087024 00000 п. 0000087192 00000 п. 0000087607 00000 п. 0000087683 00000 п. 0000087851 00000 п. 0000088266 00000 п. 0000088342 00000 п. 0000088638 00000 п. 0000089067 00000 н. 0000089143 00000 п. 0000089482 00000 п. 0000089911 00000 н. 0000089987 00000 н. 00000_{00000 п.
00000 00000 п.
0000090811 00000 п.
0000091148 00000 п.
0000091603 00000 п.
0000091679 00000 п.
0000091755 00000 п.
0000091919 00000 п.
0000092335 00000 п.
0000092411 00000 п.
0000092583 00000 п.
0000093001 00000 п.
0000093077 00000 п.
0000093343 00000 п.
0000093769 00000 п.
0000094126 00000 п.
0000094202 00000 п.
0000094500 00000 п.
0000094939 00000 п.
0000095015 00000 п.
0000095197 00000 п.
0000095610 00000 п.
0000095686 00000 п.
0000095850 00000 п.
0000096264 00000 п.
0000096340 00000 п. 0000096522 00000 п.
0000096937 00000 п.
0000097013 00000 п.
0000004956 00000 н.
трейлер
] / Назад 1697046 >>
startxref
0
%% EOF
5139 0 объект
> поток
h ޴ VkPVVB / J,
2 & d $.Y: `[~ BqayytYC] 2! -II» uLSm: 齂 = m # F {|; =}
индикатор напряжения мин 1 สุด คุ้ม — สุด ยอด ดี ล สำหรับ индикатор напряжения мин 1 จาก ผู้ ขาย индикатор напряжения мин 1 ทั่ว ทั่ว ใน AliExpress
โปรโมชัน ยอด นิยม индикатор напряжения мин. 1: ข้อ เสนอ และ ส่วนลด ออนไลน์ ที่ ดี ที่สุด พร้อม บท วิจารณ์ ของ ที่ แท้จริง
ข่าวดี! คุณ อยู่ ใน สถาน ที่ ที่ เหมาะสม индикатор напряжения мин. 1 ตอน นี้ คุณ รู้ อยู่ แล้ว ว่า สิ่ง ที่ คุณ มอง หา อยู่ คุณ แน่ใจ ได้ ว่า จะ พบ กล่าว ใน AliExpress แท้จริง เรา มี ผลิตภัณฑ์ เยี่ยม หลาย พัน รายการ ทุก หมวด หมู่ ผลิตภัณฑ์ ไม่ ว่า คุณ จะ กำลัง หา ป้าย ชื่อ ระดับ เอน ด์ หรือ การ ซื้อ สินค้า เป็น ก็ตาม เรา รับประกัน ได้ ว่า จะ มี ร้าน AliExpress อยู่ ที่ นี่ คุณ จะ พบ ค้า เป็น ทางการ พร้อม กับ ลด ราย เล็ก ๆ ทุก คน มี การ จัด ส่ง รวดเร็ว และ เชื่อถือ ได้ วิธี การ ชำระ เงิน ที่ ปลอดภัย ไม่ คุณ จะ ใช้ จ่าย เท่าไร
AliExpress จะ ไม่ ถูก เลือก ด้าน คุณภาพ และ จะ พบ ข้อ เสนอ พิเศษ แบบ ออนไลน์ ใน การ จัด เก็บ โอกาส ใน การ มาก ยิ่ง ขึ้น การ แต่ индикатор мин 1 ชุด นี้ กลาย เป็น หนึ่ง ใน ผู้ ขาย ความ สนใจ มาก ที่สุด ใน เวลา อัน รวดเร็ว ว่า อิจฉา คุณ เป็น เพื่อน จะ เป็น อย่างไร เมื่อ บอก ว่า ได้ индикатор напряжения мин 1 กับ AliExpress ด้วย ราคา ที่ ต่ำ สุด ทาง ออนไลน์ อัตรา ค่า จัด ส่ง ราคา ถูก และ เลือก การ จัด เก็บ ใน ท้องถิ่น คุณ สามารถ ประหยัด ได้ มาก ยิ่ง ขึ้น
AliExpress จะ ไม่ ถูก เลือก ด้าน คุณภาพ และ จะ พบ ข้อ เสนอ พิเศษ แบบ ออนไลน์ ใน การ จัด เก็บ โอกาส ใน การ มาก ยิ่ง ขึ้น การ แต่ индикатор мин 1 ชุด นี้ กลาย เป็น หนึ่ง ใน ผู้ ขาย ความ สนใจ มาก ที่สุด ใน เวลา อัน รวดเร็ว ว่า อิจฉา คุณ เป็น เพื่อน จะ เป็น อย่างไร เมื่อ บอก ว่า ได้ индикатор напряжения мин 1 กับ AliExpress ด้วย ราคา ที่ ต่ำ สุด ทาง ออนไลน์ อัตรา ค่า จัด ส่ง ราคา ถูก และ เลือก การ จัด เก็บ ใน ท้องถิ่น คุณ สามารถ ประหยัด ได้ มาก ยิ่ง ขึ้น
หาก คุณ ยัง คง มี คิด สอง เรื่อง เกี่ยว мин. 1 индикатор напряжения และ กำลัง คิด หา ผลิตภัณฑ์ ที่ คล้าย กัน AliExpress เป็น สถาน ที่ ยอด เยี่ยม ใน การ ราคา ผู้ ขาย เรา จะ ช่วย ให้ ว่า ควร จะ จ่าย เพิ่ม สำหรับ รุ่น ไฮ เอน ด์ หรือ ไม่ ว่า คุณ จะ ได้ รับ ข้อ พิเศษ ด้วย การ ซื้อ สินค้า ที่ ถูก ไม่ และ ถ้า คุณ เพียง ต้องการ ที่ จะ ตัว เอง และ สาด ออก ใน AliExpress มัก จะ ให้ คุณ รับ ราคา ที่ ดี ที่สุด สำหรับ เงิน ของ แม้ แจ้ง ให้ คุณ ทราบ เมื่อ คุณ จะ ดี กว่า รอ ส่งเสริม การ เริ่ม เงิน ออม ที่ คุณ คาด หวัง ได้
AliExpress มี ความ ภาค ภูมิใจ ใน การ ตรวจ ว่า คุณ มี ทาง เลือก ที่ ทราบ เมื่อ จาก ร้าน ค้า และ ผู้ ขาย กว่า ร้อย แห่ง เรา ทุก ร้าน ค้า และ ผู้ รับ การ จัด อันดับ บริการ และ คุณภาพ โดย ลูกค้า ที่ แท้จริง นอกจาก นี้ คุณ ยัง สามารถ จัด เก็บ หรือ การ ให้ คะแนน ผู้ ราย รวม ทั้ง เปรียบเทียบ ราคา การ จัด ส่ง สำหรับ ผลิตภัณฑ์ เดียวกัน โดย การ อ่าน ความ ความ เห็น ที่ ผู้ การ ครั้ง จะ ได้ รับ การ จัด อันดับ โดย ดาว และ มัก ลูกค้า ราย เดิม ที่ อธิบาย ใน การ ทำ ธุรกรรม เพื่อ ให้ คุณ สามารถ ด้วย ความ มั่นใจ ทุก ครั้ง ใน ระยะ สั้น คุณ ใช้ คำ ของ เรา แค่ ฟัง ล้าน ของ ลูกค้า มี ความ สุข
และ ถ้า คุณ ยัง ใหม่ AliExpress เรา จะ แจ้ง ให้ ทราบ โดย ละเอียด ก่อน ที่ คุณ จะ เดี๋ยวนี้ ใน ขั้น ตอน การ ทำ ธุรกรรม โปรด ครู่ เพื่อ ตรวจ สอบ คูปอง และ คุณ มาก ยิ่ง ขึ้น คุณ คูปอง คูปอง AliExpress หรือ คุณ สามารถ เก็บ คูปอง ได้ ทุก วัน โดย การ แอ ป AliExpress และ เนื่องจาก ผู้ ใหญ่ ของ เรา นำ เสนอ การ จัด ส่ง — เรา คิด ว่า คุณ จะ ยอมรับ ว่า индикатор напряжения мин. 1 รายการ นี้ indicator ราคา ที่ ดี ที่สุด ทาง ออนไลน์
Генетические индикаторы напряжения | BMC Biology
Подобно тому, как Лейбниц входит в свою мельницу разума, представьте, что он в реальном времени наблюдает за работой нервной системы с нейронами, получающими возбуждающий и тормозной постсинаптические потенциалы (EPSP и IPSP соответственно), объединяя их в общую электрическую систему. ответ и генерирование потенциалов действия (AP), которые передаются другим нейронам.Такой эксперимент в сновидении, являющийся своего рода «святым Граалем» нейробиологии, можно было провести с помощью визуализации мембранного потенциала. Вкус этого уже можно оценить по визуализации кальция [1,2,3], где, используя либо органические, либо генетически закодированные индикаторы кальция, можно отслеживать активность популяций нейронов у бодрствующих животных, хотя и с медленным разрешением по времени и без способность наблюдать отдельные спайки во время высокочастотных последовательностей спайков или измерять синаптические потенциалы [4,5,6].
Визуализация напряжения нейронов затруднена по многим причинам. Хотя мембранный потенциал весьма значителен по амплитуде (до десятых долей вольта), он существует в ограниченном пространстве, тонкой плазматической мембране и связанной с ней длине Дебая, толщиной всего несколько нанометров. Из-за этого, чтобы измерить электрическое поле, датчики должны быть нацелены с нанометровой точностью, с небольшой возможностью для ошибки. Более того, сенсоры должны быть специально нацелены на плазматическую мембрану, поскольку подавляющее большинство клеточных мембран являются внутриклеточными, которые, будучи помечены датчиками напряжения, вносят только фоновый сигнал.Помимо этой задачи нацеливания, абсолютная тонкость мембраны означает, что там можно разместить только несколько сенсорных молекул, поэтому об изменениях напряжения можно сообщить только с использованием очень небольшого количества фотонов, что требует эффективных хромофоров, сильных источников света и временного или пространственного усреднения. Тем не менее, сигналы напряжения на мембране являются миллисекундными, а нейроны имеют богатую дендритную или аксональную морфологию, где сигналы напряжения необходимо измерять, что затрудняет пространственное или временное усреднение. Еще больше усложняет ситуацию то, что даже если нацеливание было эффективным и метило все клетки и процессы, клубок нейропиля млекопитающих остается оптически неразрешимым для традиционной микроскопии.Кроме того, мембранные потенциалы градуированы по амплитуде, поэтому измерения должны иметь значительный динамический диапазон с, в идеале, линейными передаточными функциями в физиологическом диапазоне от — 100 до 100 мВ. Последняя трудность возникает из-за того, что плазматическая мембрана — это не просто еще один клеточный компартмент, а именно тот, который защищает нейрон извне и целостность которого имеет первостепенное значение. Это делает его чрезвычайно чувствительным к любым возмущениям, от добавления дополнительных молекул или зарядов, которые могут повлиять на его биохимические или электрические свойства, до фотоповреждений в результате образования свободных радикалов кислорода из-за фотовозбуждения индикаторов напряжения или эндогенных хромофоров.
Этот запретительный набор трудностей не остановил исследователей от работы с изображениями напряжения [7,8,9], что привело к появлению множества различных методологических подходов, демонстрирующих большую изобретательность [10]. В самом деле, в методах оптического измерения мембранного потенциала использовались самые разные стратегии, такие как (i) повторное разделение, когда хромофоры перемещаются внутрь и из мембраны с изменениями напряжения; (ii) переориентация, при которой электрическое поле изменяет относительное выравнивание хромофора относительно мембраны; (iii) электрохромизм, когда мембранный потенциал модулирует основное и возбужденное состояния хромофора, изменяя длину волны возбуждения или излучения; (iv) резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), когда вызванные напряжением конформационные или спектральные изменения изменяют эффективность передачи энергии хромофоров; (v) тушение, когда мембранный потенциал влияет на молекулярные взаимодействия, которые уменьшают интенсивность флуоресценции; (vi) индуцированная напряжением димеризация / агрегация хромофоров, изменяющая их спектры; (vii) электрооптическая модуляция генерации второй гармоники (ГВГ) хромофоров; (viii) плазмонный эффект наночастиц по усилению сигналов от соседних хромофоров; и (ix) отображение показателя преломления или других внутренних оптических изменений клетки из-за ее электрической активности.
Используя некоторые из этих механизмов, за последние четыре десятилетия исследователи синтезировали органические потенциалочувствительные красители для измерения мембранного потенциала in vitro и in vivo [7,8,9, 11,12,13,14]. Эти красители были особенно эффективны в препаратах беспозвоночных с большими и прочными нейронами и с небольшим нейропилем [15,16,17], а также в некоторых препаратах млекопитающих, либо in vitro [18, 19], либо путем инъекции красителей в отдельные клетки [ 20, 21] или использовать их для измерения объема ткани in vitro [22, 23] или in vivo, но без разрешения отдельных клеток [8].Несмотря на эту новаторскую работу, вольтажная визуализация препаратов млекопитающих in vivo с разрешением отдельных клеток остается проблемой, а визуализация активности нейронных цепей in vivo вместо этого обычно выполняется с помощью кальциевых индикаторов в сочетании с двухфотонным возбуждением для оптического проникновения и секционирование [4, 24, 25].
Недавняя разработка генетически кодируемых индикаторов напряжения (GEVI) представляет новую стратегию, которая с помощью белковой инженерии может преодолеть некоторые ограничения органических красителей, чувствительных к напряжению (рис. 1). Основываясь на успешной разработке генетически кодируемых индикаторов кальция [26], открытие чувствительного к напряжению домена (VSD) из фосфатазы [27, 28] позволило создать семейство GEVI, связав его с флуоресцентными белками в различных конфигурациях ( Рис.1, слева). Кроме того, было разработано второе семейство GEVI на основе микробных родопсинов, которые демонстрируют слабую, но чувствительную к напряжению флуоресценцию [29]. Наконец, третья категория генетических датчиков напряжения использует гибридный подход с взаимодействием органических и белковых компонентов [30], используя совместные преимущества химического и генетического дизайна.В следующих разделах мы даем краткий обзор этих трех семейств генетических индикаторов напряжения и даем сравнение их производительности в таблице 1. Учитывая, насколько быстро эта область развивается, наш обзор является лишь моментальным снимком во времени, и мы поощряем читателя. чтобы быть в курсе новых показателей напряжения по мере их публикации.
Рис. 1
Исторический обзор генетических индикаторов напряжения. Датчики делятся на три отдельных семейства на основе доменов измерения напряжения (VSD; слева, ), микробных родопсинов (, средний ) или хемогенетических зондов ( справа, ) и расположены в хронологическом порядке в соответствии с годом первого отчета.Цвет рамки относится к длине волны активации, указанной в документе или полученной из спектра флуоресцентного белка. Черные звезды обозначают зарегистрированные двухфотонные измерения. Обратите внимание, что HAPI-Nile Red и Voltron также основаны на родопсине. В тексте ссылки
Таблица 1 Сравнительная характеристика генетически ориентированных индикаторов напряжения. Значения взяты из литературы. NR не сообщается, RT комнатная температура
GEVI на основе чувствительных к напряжению доменов
Индикаторы напряжения на основе VSD состоят из VSD и флуоресцентного белка (рис. 2а). Первый индикатор напряжения на основе VSD, FlaSh, использовал VSD из потенциалзависимого калиевого канала [31], но имел ограниченное применение в препаратах для млекопитающих. Совсем недавно VSD фосфатазы из Ciona Кишечник [27] систематически использовался для создания GEVI с улучшенным переносом через мембрану и повышенной производительностью [32, 33]. Скрининг флуоресцентных белков, слитых с этим VSD, привел к созданию ArcLight, состоящему из VSD и мутантного суперэклиптического pHluorin [34]. Хотя ArcLight обладает хорошей чувствительностью к напряжению, его медленная кинетика флуоресценции приводит к низкой амплитуде сигнала и ограниченному временному разрешению для обнаружения пиков.Для ускорения кинетики в VSD Ciona были введены мутации, в результате чего были получены улучшенные варианты ArcLight [35,36,37]. В качестве альтернативы VSD Ciona , VSD другой потенциалочувствительной фосфатазы из Gallus gallus был использован для вставки GFP суперпапки с круговой перестановкой во внеклеточную петлю VSD, между третьей и четвертой трансмембранными спиралями, для более быстрого получения индикаторы напряжения, получившие название ускоренного датчика потенциалов действия (ASAP) [38,39,40,41]. Совсем недавно были предприняты попытки изменить полярность оптических сигналов; в отличие от некоторых из более ранних индикаторов, эти новые индикаторы напряжения (Marina, FlicR1 и FlicR2) увеличивают яркость, когда мембрана деполяризована, и демонстрируют более низкую флуоресценцию при потенциалах покоя мембраны (рис. 2b, c) [42, 43]. Кроме того, недавно были разработаны GEVI на основе VSD (рис. 2b) [42, 44, 45].
Рис. 2
Последние GEVI на основе VSD. a Схематический чертеж двух конфигураций GEVI на основе VSD. Слева : слияние VSD с внутриклеточным флуоресцентным белком (FP). Справа : вставка ДМЖП с внеклеточной циркулярной перестановкой FP. b Слева : Экспрессия FlicR1, индикатора с красным смещением и измененной полярностью, в диссоциированном нейроне гиппокампа. Правый : оптический ( красный ) и электрический ( черный ) ответы на потенциалы действия с частотой 5 Гц, зарегистрированные с помощью однофотонной визуализации. Изменено с разрешения [43]. c Слева : Экспрессия Марины, зеленого индикатора с обратной полярностью в культивируемых нейронах гиппокампа. Справа : Спонтанная импульсная активность в корковом нейроне из острого среза головного мозга, зарегистрированная с помощью однофотонной визуализации. Изменено из [44] с разрешения
GEVI на основе
VSD успешно использовались для измерений как одиночных нейронов, так и нейронных цепей, что позволяет регистрировать динамику мембранного потенциала в небольших нейронных компартментах, труднодоступных с помощью обычных электрофизиологических методов. Например, измерения мембранного потенциала в дендритных шипах in vitro были выполнены с помощью ArcLight, сочетая однофотонную визуализацию напряжения с двухфотонным снятием каркаса глутамата [46].Кроме того, потенциалы действия в дендритах, распространяющиеся в обратном направлении, регистрировались с помощью ASAP2s с двухфотонной микроскопией [40]. GEVI на основе VSD также использовались in vivo. С помощью одно- или двухфотонной визуализации с широким полем напряжения можно отобразить сенсорно-вызванные или спонтанные потенциалы с больших территорий, хотя и без разрешения отдельных клеток [47,48,49]. Мониторинг подпороговой динамики мембранного потенциала и потенциалов действия с клеточным разрешением был достигнут in vivo с использованием VSD на основе GEVI у Drosophila [39, 50].Но визуализация напряжения с разрешением отдельных клеток in vivo была сложной задачей для препаратов млекопитающих из-за рассеяния света и плохого отношения сигнал / шум (SNR). Недавно и ArcLight-MT, и недавно разработанный ASAP3 были использованы для сообщения о подпороговых потенциалах и потенциалах спонтанного действия у бодрствующих или анестезированных мышей in vivo при двухфотонном возбуждении с разрешением одной клетки [49]. Кроме того, недавно у плодовых мушек in vivo были объединены вольтаж и кальциевые изображения [39].
Хотя производительность GEVI на основе VSD улучшилась, создание изображения напряжения с их помощью все еще остается сложной задачей. Необходимы дальнейшие успехи, особенно в области визуализации in vivo. В частности, были бы желательны лучшие характеристики при двухфотонном возбуждении и разработка индикаторов с красным смещением для многоцветной визуализации и комбинации с оптогенетикой. Также представляется важным разработать более яркие GEVI на основе VSD для получения более высоких SNR, сопоставимых с визуализацией кальция. Наконец, как и в случае с другими индикаторами напряжения, быстрое фотообесцвечивание GEVI на основе VSD может помешать долгосрочному мониторингу динамики мембранного потенциала.Чтобы преодолеть фотообесцвечивание, улучшение GEVI типа Marina и FlicR кажется особенно многообещающим, поскольку они демонстрируют низкую флуоресценцию в состоянии покоя и становятся ярче при деполяризации мембранного потенциала.
GEVI на основе родопсина
GEVI на основе микробных родопсинов делятся на два различных класса. Один использует родопсин как датчик напряжения и как флуоресцентный репортер, в то время как другой использует чувствительный к напряжению родопсин, связанный с флуоресцентной меткой (рис. 3a). Первым микробным датчиком напряжения на основе родопсина был PROPS (оптический датчик протонов протеородопсина) [51].Авторы обнаружили, что в протеородопсине, поглощающем зеленый цвет, состояние протонирования основания Шиффа сетчатки (RSB), которое ковалентно прикрепляет хромофор к апопротеину, в значительной степени определяет цвет и флуоресценцию родопсина. Они пришли к выводу, что изменение мембранного напряжения должно влиять на локальный электрохимический потенциал вокруг RSB и тем самым изменять флуоресценцию белка [51]. Посредством мутагенеза естественная светоактивированная ионная транспортная активность микробного родопсина была отменена, и RSB pk _a был сдвинут, чтобы воспринимать мембранные потенциалы в физиологическом диапазоне.Использование PROPS было ограничено Escherichia coli , но, используя аналогичный механизм восприятия, Archaerhodopsin 3 из галоархей Halorubrum sodomense , известный как Arch, был впоследствии разработан для визуализации напряжения нейронов млекопитающих [29]. В последние годы усовершенствования сенсоров на основе родопсина в основном связаны с мутациями в Arch [52, 53], что привело к улучшенным индикаторам, таким как QuasAr 1-3 [54, 55], NovArch [56] и, недавно, Archon 1 и 2. [57] (рис. 1). И QuasAr3, и Archon1 использовались для успешной регистрации поездов потенциала действия in vitro с хорошим SNR [55, 57] (Таблица 1) и использовались in vivo, хотя и с однофотонным возбуждением [55, 57].
Рис. 3
Недавние ГЭВИ на основе родопсина. a Представление двух видов GEVI на основе родопсина с GEVI типа PROPS ( слева, ) и GEVI на основе eFRET ( справа ). b Слева : конфокальные изображения экспрессии QuasAr3 в срезах мозга; стержень 50 мкм. Средний : записи патч-зажим ( черный ) с соответствующими следами флуоресценции ( красный ) в острых срезах головного мозга. Справа : наложение электрического и оптического сигнала для одной точки доступа. Изменено с разрешения [55]. c Left : Экспрессия Archon1 в острых срезах головного мозга; стержень 25 мкм. Средний : флуоресценция Archon1 ( розовый ; одно испытание) и соответствующие электрические следы ( черный ) в культивируемых клетках с наложением обоих сигналов для AP, указанных стрелкой. Справа : Изменения флуоресценции (единичное испытание) Archon 1 после изменения напряжения, подобного потенциалу действия ( черный ) 200 Гц в нейроне с ограниченным напряжением в культуре.Изменено с разрешения [57]. d Слева : конфокальное изображение экспрессии VARNAM в пирамидных нейронах в фиксированных постнатальных срезах мозга. Средний : одновременные оптические ( красный ) и электрические записи ( черный ), вызванные подачей тока 10 Гц ( слева, ) и 50 Гц ( справа, ) с наложением обоих сигналов для указанной точки доступа. Правый : Изменения мембранного потенциала, вызванные активацией канала родопсина Cheriff ( синий ), отслеживаются электрически ( черный ) и оптически ( красный ). Изменено с разрешения [44]
Комбинация сенсора и репортера в одном маленьком белке в микробных родопсинах кажется элегантной и обеспечивает время отклика в субмиллисекундном диапазоне [29, 51, 54, 58] и, кроме того, большую чувствительность ( как ΔF / F на 100 мВ) от 30 до 90% [53,54,55,56,57] делают их очень многообещающими. Тем не менее, как индикаторы напряжения, микробные родопсины страдают недостатками, которые невозможно преодолеть даже в последних вариантах. Поскольку белки оптимизированы для переноса ионов, а не флуоресценции, их квантовый выход обычно на порядки ниже, чем у флуоресцентных белков, таких как GFP [29], что создает низкую яркость и требует высокой интенсивности освещения в диапазоне от нескольких десятков до сотен Вт / см. ², даже для последних вариантов [55, 57].Чтобы улучшить яркость, микробные родопсины были объединены с флуоресцентными белками, в результате чего получилась вторая подгруппа сенсоров на основе родопсина: электрохромные FRET (eFRET) GEVI (рис. 3a), где родопсин, по существу, служит VSD. Здесь флуоресцентный белок слит на С-конце с седьмой трансмембранной спиралью, обеспечивая чувствительное к напряжению безызлучательное тушение флуорофора с помощью родопсина, механизм, уже исследованный ранее с органическими красителями [59]. Первоначальные подходы объединили макродопсин, световой протонный насос из L.maculans (пик поглощения 550 нм) до mCitrine или mOrange2 [60]. Хотя MacQ-mCitrine и mOrange2 немного медленнее, чем сенсоры чистого родопсина, они все же генерируют полный амплитудный ответ в течение 5 мс и достоверно сообщают о потенциалах действия в культивируемых нейронах с 5-7% ΔF / F на спайк [60]. Следуя тому же подходу, QuasAr2 был слит с несколькими флуоресцентными белками (eGFP, Citrine, mOrange2, mRuby2), в результате чего были получены сенсоры со сходной кинетикой и чувствительностью [61]. Использование более быстрого родопсина Acetabularia (Ace) в качестве тушителя для mNeonGreen позволило значительно ускорить время отклика без потери чувствительности [62]. Последним дополнением к GEVI eFRET является недавно опубликованный VARNAM, который также использует Ace, связанный с флуоресцентным белком mRuby3. VARNAM требует низкой интенсивности света (1,5 Вт / см2), сохраняет быструю кинетику Ace-mNeonGreen и демонстрирует высокую фотостабильность [44], в то время как его активация с красным смещением делает его легко комбинируемым с оптогенетическими приводами, активируемыми синим светом. Однако даже VARNAM не смог преодолеть недостаток GEVI на основе родопсина: слабую производительность при двухфотонном освещении [44].
Хемогенетические индикаторы
Хотя GEVI имеют то преимущество, что они могут быть генетически нацелены на плазматические мембраны и клеточные популяции, они могут иметь недостатки из-за низкой яркости, плохой фотостабильности и медленной кинетики. Но, как уже упоминалось, оптические измерения потенциала клеточной мембраны выполнялись на протяжении десятилетий с использованием небольших органических синтетических молекул [12, 13, 15]. Эти красители чувствительны к напряжению, часто из-за электрохромизма, и могут иметь большие частичные изменения флуоресценции и отличные кинетические характеристики и фотофизические свойства [8, 11, 63].В то же время эти маленькие липофильные молекулы вызывают неспецифическое окрашивание ткани, серьезно нарушая SNR и разграничение клеток. Чтобы обойти эти проблемы, появилась гибридная стратегия, использующая вместе химические и генетические индикаторы: объединение оптических свойств низкомолекулярных флуорофоров с генетическим нацеливанием (рис. 1) [30, 64, 65, 66]. Термин «хемогенетика», обычно используемый для небольшой молекулы, которая активирует генно-инженерные белки, был применен к этим гибридным индикаторам напряжения [67].Мы рассматриваем три общих класса индикаторов хемогенетики в соответствии с молекулярным механизмом сенсорного домена и флуоресцентного репортера.
Хемогенетические сенсоры на основе FRET
В одном из первых хемогенетических сенсоров, названном гибридным сенсором напряжения (hVOS), использовалась экзогенно добавленная липофильная молекула, которая в зависимости от напряжения подавляла флуоресцентные белки, задействованные в мембране. hVOS использовала двухкомпонентную стратегию на основе FRET, изначально разработанную без генетических компонентов [68], но адаптированную для генетического нацеливания (рис.4а) [69,70,71,72,73]. Первый компонент состоит из флуоресцентного белка с присоединенными фарнезилированными и пальмитоилированными мотивами, которые прикрепляют его к плазматической мембране [70, 72]. Второй компонент — нефлуоресцентное синтетическое соединение дипикриламин (DPA), которое служит в качестве чувствительного к напряжению акцептора FRET (тушителя). Поскольку DPA является липофильным, но отрицательно заряженным, он распределяется в мембране в зависимости от напряжения, перемещаясь во внутренний слой во время деполяризации, что гасит флуоресценцию белка.Но поскольку DPA увеличивает емкость мембраны, следует использовать низкую концентрацию, чтобы не нарушать естественные физиологические реакции [73]. Недавнее использование этого сенсора показывает большую универсальность для представления активности нервной популяции с использованием клеточно-специфического генетического нацеливания у трансгенных мышей (рис. 4b).
Рис. 4
Хемогенетические индикаторы напряжения. a Схематическое изображение hVOS, состоящего из флуоресцентного белка, прикрепленного к плазматической мембране, в сочетании с нефлуоресцентным синтетическим соединением дипикриламином (DPA), которое служит в качестве чувствительного к напряжению акцептора FRET. b Сотовая визуализация напряжения с разрешением hVOS. Срезы гиппокампа мышей hVOS :: Fos, экспрессирующих зонд hVOS в гранулярных клетках Cre-Fos-зависимым образом. Слева : Флуоресценция в срезах мозга после скрещивания Ai35-hVOS с мышами Cre-Fos, демонстрирующая нейроны, экспрессирующие hVOS, в слое гранулярных клеток гиппокампа. Справа : Ответ в четырех нейронах в срезе гиппокампа от мыши hVOS :: Fos на электрическую стимуляцию. c Схематическое изображение VoltageSpy, состоящего из экспрессии SpyCatcher на клеточной поверхности и последующего внеклеточного взаимодействия с красителем VF. d Визуализация субклеточного напряжения с помощью VoltageSpy. Культивированные нейроны гиппокампа, коэкспрессирующие SpyCatcher и ядерный mCherry и меченные VoltageSpy, были захвачены при 500 Гц под широкопольным флуоресцентным микроскопом. Слева : VoltageSpy показано зеленым цветом , а окрашивание ядер — красным цветом . Средний : большее увеличение выбранных дендритных областей. Масштабная линейка 20 мкм. Справа : Отображение напряжения в дендритах, показывающее вызванные потенциалы действия в выбранных областях интереса, закодированные цветами, указанными на панели.Изображения и следы изменены с разрешения [69] ( b ) и [82] ( d )
Второй тип хемогенетических датчиков на основе FRET использует микробные родопсины в качестве датчиков [61, 62]. Как уже упоминалось, колебания мембранного напряжения вызывают изменение абсорбции родопсинов, которое может быть считано с помощью сайт-специфически лигированного органического флуорофора. Электрохромный FRET родопсина с помощью лигирования флуорофора (FlareFRET) действует как флуорофор, селективно присоединенный к неприродной аминокислоте, кодируемой внутри родопсина [74].Этот датчик обладает широкой универсальностью, позволяя добавлять цветовую палитру и достигать 35,9% ΔF / F на 100 мВ и отклик в миллисекундах.
Наконец, недавняя разработка новых родаминовых красителей с высокой фотостабильностью и яркостью, таких как серия Janelia Fluor (JF), привела к разработке Voltron [42]. JFs совместимы с белковыми метками и пересекают гематоэнцефалический барьер в экспериментах на млекопитающих in vivo. Voltron сочетает в себе чувствительный к напряжению микробный родопсин с самомеченным белковым доменом, который ковалентно связывает синтетический флуорофор JF [75, 76].Зависимые от напряжения изменения в спектре поглощения родопсина обратимо модулируют степень тушения флуоресценции красителя посредством FRET. С помощью Voltron можно измерять импульсные нейронные импульсы и подпороговые напряжения в личиночных рыбках данио, плодовых мушках и мозге мышей [42].
Хемогенетические сенсоры на основе ферментов
Эта конструкция основана на генетически закодированном ферменте на поверхности клетки, который активирует предшественник органического индикатора напряжения. Например, водорастворимый краситель-предшественник гидролизуется щелочной фосфатазой, которая отщепляет полярную группу, усиливая ее липофильный характер [30].Это значительно улучшает нацеливание и накопление модифицированного электрохромного красителя в мембране клетки, экспрессирующей фосфатазу. Хромофор аминостирилпиридиния (ASP) является примером чувствительного к напряжению предшественника красителя с фосфатной группой, присоединенной к его головной группе [30, 65]. Первое поколение красителей на основе ASP приводило к окрашиванию внутренних органелл за секунды. Используя ту же стратегию, второе поколение сенсоров с использованием ANNINE-6, одного из наиболее чувствительных к напряжению красителей, показало изменение интенсивности ΔF / F на 50% на 100 мВ и могло быть использовано для нацеливания in vivo [66]. Одним из основных преимуществ этих методов является то, что мембраны можно маркировать большим количеством молекул.
Новое поколение сенсоров на основе ферментов (VF-EX) представляет собой хемогенетический зонд, в котором генетически кодируемая эстераза выводит из клетки краситель VF в определенных нейронах [77]. Затем VF использует фотоиндуцированный перенос электронов (PeT) в качестве триггера интенсивности флуоресценции, зависящего от мембранного потенциала [78,79,80]. VF обладает скоростью, яркостью и чувствительностью, чтобы сообщать о потенциалах действия в нейронах в единичных испытаниях.Кроме того, VF химически модифицирован, чтобы он был минимально флуоресцентным в качестве предшественника и активируется при ферментативной активности. Нацеленная эстераза печени свиньи (PLE) на мембране расщепляет VF на поверхности клетки [81]. Используя этот подход, можно измерить потенциалы действия в культивируемых нейронах [77]. Кроме того, по сравнению с некоторыми GEVI [70], VF-EX демонстрирует улучшенное соотношение сигнал / шум и изменение флуоресценции, мечение дендритов и дендритных шипов [77].
Хемогенетические датчики с привязкой к метке
Последняя категория хемогенетических зондов улавливает химические флуорофоры в плазматической мембране с помощью белкового каркаса.В системе VoltageSpy используется сконструированная молекула клеточной адгезии, взаимодействующая с красителем VF, содержащим саркозин (рис. 4a). Это взаимодействие стало возможным благодаря линкеру полиэтиленгликоля (ПЭГ) между небольшим пептидом из 13 остатков и красителем VF [82]. Локализация VoltageSpy определяется экспрессией белка SpyCatcher на клеточной поверхности. Об улучшении обнаружения напряжения по сравнению с обычно используемыми генетическими индикаторами напряжения в культуральных клетках сообщалось для VoltageSpy [82].С помощью этого датчика можно измерять напряжения в терминалах аксонов, дендритах и шипах (рис. 4d). Наконец, гибридный сенсор, прикрепленный к белковой метке, HAPI-Nile, основанный на индикаторе напряжения Nile Red, демонстрирует флуоресцентные изменения в физиологическом диапазоне мембранного потенциала [83]. С помощью этого зонда можно обнаруживать запускаемые потенциалы действия и над / подпороговую активность в культивируемых нейронах.
Селективная локализация синтетического индикатора напряжения в интересующих клетках с использованием генетически закодированных белковых тегов кажется многообещающей.Некоторые проблемы, связанные с этими гибридными хемогенетическими стратегиями, связаны с их потенциальной токсичностью и избирательным применением экзогенного липофильного соединения к нейрональным мембранам в интактной ткани для использования in vivo.
Быстрая двухфотонная визуализация динамики внутриклеточного напряжения в нейрональной ткани с генетически закодированными индикаторами
Существенные изменения:
1) Одна из основных проблем заключается в том, что совсем не ясно, какова взаимосвязь между этим отчетом, в котором представлены ASAP2, и исследованием 2016 года аналогичной группы авторов (Cell, 2016, 166, p245), в котором раскрывается ASAP2f. Очевидно, мутации разные, но нет сравнения между 2s и 2f. Поскольку это в основном одна и та же группа авторов, они должны иметь доступ к соответствующим конструкциям ДНК и даже к необходимым генетически модифицированным организмам. По крайней мере, следует обсудить относительные преимущества 2s по сравнению с 2f. Необязательно быть явным «победителем» — хорошо иметь множество методологий, которые можно использовать, но эта статья не проясняет путаницу в отношении того, какую плазмиду запросит потенциальный пользователь.К этим соображениям следует обратиться: в идеале с помощью экспериментов и, как минимум, обсуждения. Также следует провести сравнения с другим «современным» индикатором, mAce-Neon, созданным Schnitzer. Поскольку у этих исследований есть общий соавтор, это должно быть осуществимо.
Мы согласны с рецензентами, что дополнительные сравнения с ASAP2f и Ace2N-mNeon будут информативными. Для контекста, эти датчики не были хорошо охарактеризованы («оптимизированный для полета» датчик ASAP2f) или опубликованы (индикатор FRET-opsin Ace2N-mNeon), когда мы начали эту работу, поэтому мы изначально выбрали другие индикаторы напряжения в качестве эталонных GEVI. Небольшое уточнение: на самом деле нет общих соавторов с докладом Ace2N-mNeon Science из лаборатории Шнитцера.
Чтобы учесть опасения рецензентов, мы провели несколько новых экспериментов по сравнению ASAP2 с ASAP2f и Ace2N-mNeon. Сначала мы оценили ответ Ace2N-mNeon в терминалах аксона L2 Drosophila . Мы наблюдали минимальный (но обнаруживаемый) ответ (рис. 3B), что согласуется с предыдущим исследованием, показывающим снижение чувствительности других индикаторов на основе опсина при двухфотонном освещении (Brinks D, Klein AJ, Cohen AE (2015).Biophys J 109: 914–921). Мы также выразили этот показатель в органотипических культурах срезов и обнаружили, что значительная часть флуоресценции оказалась цитоплазматической (Рисунок 4 — рисунок в приложении 4), как мы также наблюдали в диссоциированных культурах нейронов (Рисунок 2 — рисунок в приложении 2). Затем мы количественно оценили его флуоресцентные реакции на ступенчатую деполяризацию с помощью многофотонной микроскопии с произвольным доступом. В соответствии с нашими результатами для Drosophila , Ace2N-mNeon работал плохо, давая лишь ~ 2% фракционного изменения флуоресценции до ступенчатой деполяризации 100 мВ (Рисунок 4 — рисунок в приложении 4CD).
Затем мы сравнили ASAP2f с ASAP1 и ASAP2. Сначала мы подтвердили, что все индикаторы ASAP хорошо локализованы на плазматической мембране в диссоциированных культурах нейронов (рисунок 2 — приложение к рисунку 2). Во-вторых, учитывая, что о его эффективности в терминалах аксона L2 Drosophila уже сообщалось (Yang HH, et al. (2016) Cell 166: 245–257), мы не дублировали результаты здесь, а вместо этого упомянули эти результаты в основном текст.
Затем мы попытались всесторонне протестировать ASAP2f в наших экспериментах по многофотонной микроскопии с произвольным доступом на органотипических культурах срезов.В идентичных условиях мы наблюдали, что ASAP2f работает аналогично ASAP1 по всем показателям, включая яркость (Рисунок 4 — дополнение к рисунку 3B), пиковую амплитуду ответа на вызванные AP (Рисунок 4 — приложение к рисунку 3C), кинетику (Рисунок 6 — приложение к рисунку 2 ), отношение сигнал / шум при сообщении об отдельных точках доступа (рисунок 7 — дополнение к рисунку 1) и пиковая амплитуда отклика на отдельные пики в цепочках точек доступа (рисунок 8 — приложение к рисунку 2).
2) Новый GEVI несколько более чувствителен и несколько медленнее, чем ASAP1.Этот компромисс приводит к улучшенным способностям обнаружения всплесков в тестируемых условиях, хотя и за счет точности воспроизведения формы волны. Каков верхний предел скорости пиков, который может быть обнаружен этим новым, более медленным ASAP2? Долгое время проблемой генетически кодируемых индикаторов напряжения (помимо плохого мембранного переноса) была чрезмерно медленная кинетика. Теперь, похоже, он сдвинулся в другом направлении. Более низкая скорость ASAP2 обеспечивает более яркие сигналы, но достаточно ли она для быстрых всплесков? Каков верхний предел (т.е. когда следует переходить на ASAP1 или ASAP2f?) Продажа снижения скорости GEVI как положительного атрибута нового GEVI скорее вводит в заблуждение.
Мы согласны с рецензентами в том, что анализ обнаружения частоты всплесков был бы полезен для пользователей, выбирающих между различными членами семейства GEVI ASAP для визуализации нейронов с более быстрыми всплесками. Чтобы ответить на этот вопрос, мы сначала вызвали потенциалы действия в органотипических срезах гиппокампа при 10, 30 и 100 Гц. Затем мы измерили оптический отклик на каждый потенциал действия (AP) в поезде.Чтобы количественно оценить результаты, мы расширили предыдущую аналитическую структуру для обнаружения спайков (Wilt BA, Fitzgerald JE, Schnitzer MJ (2013). Biophys J 104: 51–62), чтобы анализировать последовательности спайков, а не отдельные спайки. Результаты представлены на Рисунке 8 и Рисунке 8 — дополнения к рисунку 1,2. Как и ожидалось, обнаруживаемость шипов в поездах уменьшалась с увеличением частоты поездов. ASAP2 работали лучше, чем ASAP1 на частотах 30 Гц или ниже, но их производительность была почти такой же (но низкой) на 100 Гц.Во многом это связано с тем, что улучшенная чувствительность ASAP2 уравновешивает его более медленную кинетику на этой частоте пикового сигнала.
3) Работает ли ASAP2 лучше в режиме 2P исключительно из-за изменения постоянной времени + улучшенной чувствительности, или произошли изменения в фотофизике самого FP? (т. е.является ли FP более ярким либо по квантовому выходу, либо по поглощению 2P?).
Что касается обнаружения пиков, усовершенствования ASAP2 в значительной степени связаны с улучшением чувствительности и более медленным отклонением от кинетики.Используя показатель d ’в качестве меры обнаруживаемости (Wilt BA, Fitzgerald JE, Schnitzer MJ (2013)), мы количественно оценили вклад параметров, ведущих к лучшей обнаруживаемости ASAP. d ’пропорционален чувствительности (ΔF / F), квадратному корню из постоянной времени вне кинетики и квадратному корню из яркости. По сравнению с ASAP1, улучшение d ’для обнаружения всплесков с помощью ASAP2, таким образом, прогнозируется в среднем чуть менее чем в два раза из-за повышения чувствительности и более чем в два раза из-за больших некинетических постоянных времени.Мы не обнаружили статистически значимого изменения молекулярной яркости ASAP2s по сравнению с ASAP1 в клетках HEK293 (рис. 1 — приложение 2) или яркости клеток в органотипических срезах (рис. 4).
Как рассчитывалась емкость мембраны и другие параметры на рис. 4 — дополнение к рисунку 1? Емкость была бы значением, которое, как я ожидал, вырастет при введении чувствительных к напряжению доменов в плазматическую мембрану. Похоже, что числовое значение емкости ASAP2s выше, чем у нетрансфицированных ячеек (разброс данных на нетрансфицированном баре больше).
Потенциал покоя, емкость и входное сопротивление мембраны были рассчитаны в режиме целой клетки с использованием программного обеспечения pClamp (Molecular Devices), с дополнительной информацией, представленной в материалах и методах. Мы согласны с обозревателями в том, что увеличение емкости прогнозируется с учетом зарядов, присутствующих на индикаторах напряжения. Однако это увеличение оказалось достаточно небольшим, так что емкость клеток, выражающих индикаторы напряжения, статистически не отличалась от емкости нетрансфицированных клеток.Это наблюдение согласуется с другими отчетами, показывающими отсутствие или умеренные изменения переменных, которые частично зависят от емкости мембраны (как описано в: Yang HH, St-Pierre F (2016). J Neurosci 36: 9977–9989). Однако, учитывая, что в предыдущем исследовании с использованием (связанного) индикатора напряжения ArcLight сообщалось об увеличении емкости, мы добавили в текст предложение, рекомендующее пользователям повторно оценивать электрические свойства мембраны при изменении условий выражения индикатора. Мы также улучшили описание этих данных, преобразовав наши гистограммы в диаграммы с ячейками и усами.Мы также добавили данные для ASAP2f с учетом новых экспериментов, которые мы провели с этим индикатором в этой измененной рукописи.
4) Было бы полезно более детально обсудить фотообесцвечивание при освещении 2P. При заданной интенсивности освещения, числовой апертуре, длительности импульса и длине волны можно было бы ожидать, что скорость фотообесцвечивания будет пропорциональна скважности освещения в каждом пикселе, то есть части времени, в течение которого лазер находится на пикселе. Для измерений фотообесцвечивания на рисунке 1 — приложение к рисунку 4A, рабочий цикл составляет ~ 10 ^ -6 (0. 4 мкс на пиксель x 2,23 Гц). Для приложений в культуре срезов рабочий цикл составляет ~ 0,04 (50 мкс на воксел x 925 Гц). Это 40 000-кратная разница в дозе освещения на воксель. Авторы должны обсудить важность рабочего цикла освещения в определении скорости фотообесцвечивания.
Удивительно, но постоянные времени быстрого фотообесцвечивания различались только в ~ 100 раз (5 с в таблице на рисунке 1 — приложение к рисунку 4B против 0,04 с на рисунке 6 — приложение к рисунку 1).Это несоответствие заслуживает комментария.
Мы согласны с рецензентами в том, что было бы полезно более подробное обсуждение и характеристика фотообесцвечивания. Поэтому мы выполнили несколько новых экспериментов (рис. 1 — приложения к рисункам 3, 4) и значительно расширили наше обсуждение фотостабильности в основном тексте. Во-первых, мы проверили, как кинетика фотообесцвечивания меняется в зависимости от мощности двухфотонного лазера, сохраняя все остальные параметры изображения постоянными (Рисунок 1 — приложение к рисунку 4C, D). Как и предполагалось, реакция была нелинейной. Он также был очень сложным, так как кривые малой мощности лучше описывать с помощью дополнительной постоянной времени. Как и предполагалось, мы также обсудили влияние рабочего цикла пикселя на фотообесцвечивание. Далее мы покажем, как следует рассматривать вместе рабочий цикл пикселя и мощность лазера (т.е. что ключевым определяющим фактором является мощность на пиксель). В частности, два условия с разной мощностью лазера, частотой кадров и временем задержки — но с одинаковой мощностью на пиксель — дали сравнимое фотообесцвечивание (Рисунок 1 — приложение к рисунку 4E).Мы также тщательно охарактеризовали обратимое фотообесцвечивание, о чем будет сказано ниже.
Мы также стремились рассмотреть конкретный пример, упомянутый рецензентами. С учетом различий в уровнях мощности и с учетом коррекции времени пребывания пикселя (рисунок 1 — приложение к рисунку 4A) разница в мощности на пиксель между двумя анализами составляет ~ 8000. Это действительно больше, чем разница во времени. Однако сравнить эти два состояния крайне сложно как минимум по трем причинам:
a) Если двухфотонное фотообесцвечивание по крайней мере пропорционально квадрату мощности лазера (например,грамм. Охейм и др. 2001. J Neurosci Methods 111: 29–37), затем быстрый компонент рисунка 1 — приложение к рисунку 4A. будет на порядки меньше, чем время экспозиции ~ 2 мс на изображение на рис. 6 — дополнение к рисунку 1. В результате это будет обнаружено как фотообесцвечивание и просто появится как более низкая яркость в первой точке данных. Другими словами, компоненты быстрого фотообесцвечивания двух экспериментов могут не быть функционально эквивалентными.
b) Разница в мощности на пиксель настолько велика, что механизмы фотообесцвечивания GFP могут механически отличаться.Например, в гораздо меньшем диапазоне мощности мы уже видим, что количество экспоненциальных членов, необходимых для соответствия кинетике фотообесцвечивания, изменяется в зависимости от мощности лазера (Рисунок 1 — рисунок в дополнении 4C, D).
c) Два эксперимента различаются оборудованием, методикой микроскопии и биологическим препаратом. Например, формирование изображения на рис. 1 — приложение к рисунку 4A было выполнено путем непрерывного перемещения лазера (растровое сканирование) и использовался объектив 60X. Между тем, рисунок 6 — дополнение к рисунку 1 был выполнен путем быстрого перемещения лазерного луча с использованием акустооптических дефлекторов для изображения только выбранных вокселей сотовой связи и с использованием объектива 25X.Эти различия будут влиять, например, на фактическую освещенность (мощность на единицу площади). Другое важное отличие состоит в том, что лазерные импульсы на фиг.1 — дополнение к рисунку 4A были предварительно компенсированы дисперсией лазерных импульсов на оптическом пути микроскопа, в то время как импульсы на фиг.6 — добавление к рисунку 1 — нет. Более того, ожидается, что рассеяние возбуждающего света будет больше для эксперимента. Фиг. 6 — дополнение к рисунку 1, которое было выполнено на клетках в ткани , по сравнению с фиг. 1 — приложение к рисунку 4A, которое было выполнено для диссоциированных клеток в среде.Наконец, внеклеточная среда различается между двумя состояниями, параметр, который может иметь значение, учитывая, что GFP в ASAP является внеклеточным и циркулярно пермутированным и, следовательно, может быть чувствительным к своему окружению.
Учитывая вышеизложенное, Обсуждение теперь рекомендует пользователям переоценить некоторые показатели производительности при развертывании индикаторов в новых экспериментальных препаратах или при использовании других условий освещения.
Наличие нескольких временных шкал в фотообесцвечивании заслуживает некоторых комментариев и анализа.Можно предположить, что быстрая шкала времени представляет фотообесцвечивание молекул непосредственно под фокусом лазера, тогда как более медленная шкала времени представляет истощение окружающих молекул по мере того, как они диффундируют в фокус. Если это предположение верно, то авторы могут частично «восстановить» более высокую флуоресценцию клетки либо путем кратковременного отключения лазера (чтобы градиенты концентрации GEVI могли рассеяться), либо путем смещения пятен освещения в новые места. Демонстрация того, что с помощью этих подходов можно частично противодействовать фотообесцвечиванию, поможет развеять некоторые опасения, связанные с визуализацией 2P напряжения.
Не факт, что 2P-визуализация — лучший подход к визуализации напряжения в ткани. Количество точек, которые можно мультиплексировать с высоким временным разрешением, ограничено, и фотообесцвечивание является серьезной проблемой. Более подробное обсуждение вопросов фотообесцвечивания могло бы существенно продвинуть это обсуждение.
Константы времени быстрого и медленного фотообесцвечивания наблюдаются с суперпапками GFP, родительским белком GFP в индикаторах ASAP (Pédelacq J-D et al.(2006) Nat Biotechnol 24: 79–88), предполагая, что по крайней мере некоторые из временных шкал фотообесцвечивания ASAP1 / ASAP2 являются внутренним молекулярным свойством. Отредактированная рукопись теперь ссылается на это исследование, чтобы предоставить контекст для наблюдаемых множественных экспонент.
Затем мы последовали рекомендации рецензентов по количественной оценке флуоресценции после перерывов в освещении. Как при одно-, так и при двухфотонном освещении, мы наблюдали частичное восстановление флуоресценции после периода инкубации в темноте (Рисунок 1 — приложения к рисункам 3 и 4).Это восстановление флуоресценции может представлять собой превращение обесцвеченных молекул в небеленые в темноте, диффузию небеленых зондов в освещенную область или и то, и другое. Таким образом, промежутки в освещении могут обеспечить стратегию частичного смягчения фотообесцвечивания в экспериментах, которые могут выдерживать регулярные инкубации в темноте.
Мы также отмечаем, что наша система визуализации RAMP исключает подавляющее большинство доступных фотонов на ячейку, записывая только меньшее количество небольших вокселей. В случаях, когда субклеточное разрешение не требуется, расширение функции рассеяния точки светового луча может обеспечить возбуждение всей сомы, а не небольшого количества вокселов. Этот подход потребует более низкой мощности света для получения идентичной общей флуоресценции, тем самым уменьшая кинетику фотообесцвечивания. Мы включили это возможное решение в обсуждение и упомянули, что дальнейшее улучшение фотостабильности индикаторов будет иметь решающее значение для долгосрочной визуализации.
5) Статья также должна быть более конкретной в Резюме и повсюду, что эксперименты с «тканью мозга» грызунов проводятся на органотипических культурах срезов. Не хороните этот факт. Во многих местах в рукописи просто говорится о «срезе мозга» или «неповрежденной мозговой ткани».Авторы должны ссылаться исключительно на «культуру органотипических срезов».
Мы согласны с тем, что «культура органотипических срезов» является более конкретным, и внесли рекомендуемые изменения в текст. Мы сохранили более общие термины (например, «ткань головного мозга») при обсуждении использования индикаторов напряжения в более общем плане, охватывая наши результаты как in vivo (муха), так и при получении органотипических культур срезов.
С точки зрения приложений нейробиологии, существует огромная разница между острым срезом и культивированным срезом.Они также отличаются с точки зрения оптики: культивированные срезы тоньше и реже, обеспечивая гораздо лучшее качество изображения, чем острые срезы. Воздействие работы было бы больше, если бы авторы смотрели в острый срез и, например, характеризовал, насколько глубоко они могли изображать.
Мы согласны с рецензентами в том, что острые срезы являются очень ценным экспериментальным препаратом, и надеемся подтвердить, что наши результаты распространяются на острые срезы в будущей рукописи. Для контекста мы визуализировали нейроны на глубине от 20 до 70 мкм от поверхности, избегая первых 20 мкм, как это делается при записи с острых срезов, чтобы избежать нейронов более низкого качества (Booker et al.(2014) J Vis Exp 91: 51706). Этот диапазон глубины записи также сопоставим с тем, что обычно делается при фиксации клеток в острых срезах (Okada Y. (2012) Методы фиксации пластырей: от начальных до расширенных протоколов). Заклеивание клеток на глубине более 100 мкм является сложной задачей, потому что клетки и электроды пипеток становится трудно визуализировать с использованием проходящего света на более глубоких участках. В то время как двухфотонная визуализация позволяет возбуждать флуорофоры на больших глубинах, в этой рукописи была предпринята попытка сравнить наши оптические сигналы с «достоверной информацией», полученной при одновременных электрических записях.
Следует отметить, что наш детектор расположен под срезом, а не над объективом (рис. 4A). Учитывая толщину нашего среза ~ 150 мкм и отображаемые нейроны на расстоянии 20-70 мкм от верхней поверхности среза, испускаемые фотоны должны пройти через ткань толщиной 80-130 мкм, прежде чем они достигнут детектора. У многих вертикальных систем визуализации детекторы расположены над объективом, поэтому SNR будет варьироваться в основном в зависимости от глубины отображаемой ячейки, а не толщины среза.
Хотя органотипические культуры срезов явно отличаются от острых срезов, многие ученые считают их ценными препаратами для изучения гиппокампа, поскольку они сохраняют важные физиологические свойства. Например, основные нейроны гиппокампа в органотипических срезах поддерживают нормальную цитоархитектуру, растут слоями (Stoppini L et al. (1991) J.Neurosci Methods 37: 173-182) и имеют дендритную морфологию, сопоставимую с соответствующими возрасту острыми срезами (De Simoni A, Griesinger CB, Edwards FA (2003).J Physiol 550: 135–147). Кроме того, по сравнению с острыми срезами, органотипические срезы обладают тем преимуществом, что легче поддаются трансфекции. По этим причинам мы решили проводить наши эксперименты на органотипических культурах срезов.
В целом, мы согласны с рецензентами в том, что острые срезы являются ценным препаратом, который мы должны оценить в будущей работе, поскольку они лучше сохраняют эндогенные нейронные связи и часто представляют собой более сложную среду для визуализации.Наши текущие результаты, демонстрирующие быструю визуализацию двухфотонного напряжения в сочетании с записью патч-зажима в органотипических культурах срезов, мотивируют дальнейшую оценку визуализации напряжения в острых срезах и in vivo.
Было много применений GEVI в органотипической культуре срезов с 1P-визуализацией. Не очевидно, что визуализация 2P в органотипических культурах срезов позволяет применять приложения, которые не могли быть достигнуты с помощью более широко доступных методов 1P.
Мы согласны с тем, что отображение напряжения 1P в срезах также может быть полезным.Однако эксперименты 1P с широкопольной визуализацией обычно основываются на разреженной экспрессии сенсора, чтобы избежать свертывания сигналов от нейронов, расположенных выше или ниже плоскости фокуса. Перекрытие сигналов особенно проблематично для индикаторов, ярких при потенциале мембраны покоя, категории, которая включает в себя многие из наиболее эффективных GEVI. 2P смягчает эту проблему, обеспечивая значительно улучшенное оптическое сечение. 2P также обеспечивает большее фокальное возбуждение, уменьшая фототоксичность нейронов за пределами фокальной области.Это важное преимущество, учитывая, что для формирования изображения напряжения обычно требуется непрерывное освещение при относительно высокой мощности.
No related posts.